El Grupo de Perth sostiene que nadie ha demostrado la existencia del virus VIH, y que el sida se debe a la oxidación.

viernes, 14 de junio de 2013

¿Ha probado Gallo el papel del VIH en el SIDA?



theperthgroup.com/SCIPAPERS/EPEGalloProveRoleHIVEmergMedOCR1993.pdf

theperthgroup.com/SCIPAPERS/emedhivgallo.html

virusmyth.com/aids/hiv/epgallo.htm



Emergency Medicine 1993;5:5-147


¿Ha probado Gallo el papel del VIH en el sida?.


Se analizan críticamente los datos que Robert Gallo y sus colegas presentaron el 4 de mayo de 1984 considerando el aislamiento del HTLV-III (VIH) y el rol del VIH en la patogénesis del sida. Se concluye que los datos no constituyen prueba del aislamiento de un retrovirus, que el virus sea exógeno o que el virus esté causalmente relacionado con el sida.


Introducción

En 1982, Robert Gallo, del National Cancer Institute de los Estados Unidos, propuso la hipótesis de que la causa del sida era un retrovirus. Un año después, Myron Essex y sus colegas (1) descubrieron que los pacientes de sida tenían anticuerpos al virus de Leucemia de células T Humano Tipo 1 (HTLV-I), un virus descubierto por Gallo unos años antes. Al mismo tiempo, Gallo y sus colegas (2) informaron del aislamiento del HTLV-I en pacientes de sida y propusieron que este retrovirus tenía un papel en la patogénesis del sida. Sin embargo, esta hipótesis tuvo algunos problemas:

1. Mientras que se aceptó que el HTLV-I inducía proliferación de células T4 y causaba leucemia de células T adultas (3), la "marca distintiva" del sida era la disminución de células T4, y la incidencia de leucemia en pacientes de sida no era más alta que en la población general;

2. La mayor frecuencia de anticuerpos a este virus se encontró en Japón, pero no se había informado de casos de sida en este país (4);

3. En el mismo mes en que los grupos de Gallo y Essex reportaron sus datos, Luc Montagnier y sus colegas del Instituto Pasteur describieron el aislamiento de un retrovirus, más tarde conocido como Virus Asociado a Linfadenopatía (LAV), a partir de los ganglios linfáticos de un paciente homosexual con linfadenopatía (5). Aunque este virus era similar al HTLV-I, una de sus proteínas, una proteína con un peso molecular de 24.000 (p24), no reaccionaba con los anticuerpos monoclonales a la proteína p24 del HTLV-I. Se enviaron en varias ocasiones muestras del virus al laboratorio de Gallo.

En mayo de 1984, Gallo, Popovic y sus colegas publicaron cuatro artículos en Science en donde afirmaban haber aislado otro retrovirus en pacientes de sida, al que llamaron HTLV-III (6,7,8,9). El 23 de abril de 1984, antes de que los artículos de Science se publicaran, Gallo y Margaret Heckler, la entonces secretaria del Health and Human Services, convocaron una rueda de prensa para anunciar que Gallo y sus colegas habían encontrado la causa del sida, y habían desarrollado un test sensitivo para mostrar si el "virus del sida" estaba presente en la sangre.

En 1985, el Instituto Pasteur alegó que Gallo había utilizado de modo deshonesto el LAV al desarrollar el test de anticuerpos. El conflicto jurídico, que llegó a las cortes americanas, se solventó finalmente mediante un acuerdo negociado, firmado en 1987 por Gallo, Montagnier, el presidente americano Reagan y el presidente del gobierno francés Chirac. El acuerdo declaró a Gallo y Montagnier como los codescubridores del virus del sida, actualmente conocido como Virus de Inmunodeficiencia Adquirida (VIH). Sin embargo, el conflicto de uso indebido llamó la atención de John Crewdson, un periodista de investigación, y del senador americano John Dingell. En noviembre de 1989, Crewdson publicó un largo artículo en el periódico Chicago Tribune, "Con acusaciones de que Robert C. Gallo había robado a los científicos franceses el virus que había descubierto como la causa del sida" (10). Esto llevó a una "investigación" interna del National Institute of Health (NIH) por las acusaciones, con "un comité externo de partes expertas y desinteresadas [conducido por el bioquímico de Yale Frederic Richards] para supervisar la actividad del panel interno" (11).

Siguiendo a la investigación, que fue vista como una misión de determinación de hechos, el comité de Richards insistió en una "investigación formal ... por datos sospechosos de uno de los cuatro trascendentales artículos publicados por el laboratorio de Gallo en Science el 4 de mayo de 1984" (12). En este artículo, el primero de una serie de cuatro, con Mikulas Popovic como el autor principal, "parece haber diferencias entre lo que fue descrito en el artículo y lo que fue hecho" (10). En septiembre de 1991 se publicó un proyecto de informe de la investigación formal, escrito por el NIH Office of Scientific Integrity (OSI). En ese informe se acusa a Popovic de "mala conducta por declaraciones falsas e inexactitudes" que aparecen en el artículo, y que Gallo, como responsable principal del laboratorio, "creó y fomentó las condiciones que dieron lugar a datos falsificados-fabricados e informes falsificados". Sin embargo, las acciones de Gallo no se consideraron que "cumplieran la definición formal de mala conducta" (13).

El proyecto de informe final del OSI, completado en 1992, fue inmediatamente criticado por el comité de Richards, así como por el senador Dingell. Esto llevó a una revisión del informe del OSI por parte del Office of Research Integrity (ORI), que encontró a Gallo culpable de mala conducta científica. No obstante, la mala conducta científica "no niega los descubrimentos fundamentales del artículo [de Science de 1984]" (13,14). Es decir, a pesar de todo lo anterior, en la actualidad se acepta todavía, como Gallo y sus colegas concluyeron, que "Los resultados presentados en nuestros cuatro artículos proporcionan pruebas claras de que la etiología del sida y el ARC era el nuevo retrovirus linfotrópico HTLV-III" (15) [ARC = complejo relacionado con el sida]. Aunque los hallazgos de la investigación de Gallo son de importancia considerable, en lo que sigue, con algunas excepciones, nosotros consideraremos que no hubo "diferencias entre lo que se describió en el artículo y lo que fue hecho". Sin embargo, los datos se analizarán críticamente con respecto a lo siguiente:

1. Si el método experimental descrito constituye una prueba irrevocable de aislamiento de virus;

2. Si los autores presentaron pruebas de la relación causal entre el VIH y el sida.

Para facilitar este análisis puede ser útil considerar lo que es generalmente aceptado como aislamiento de retrovirus.


Aislamiento de retrovirus

El descubrimiento y aislamiento del primer retrovirus se le atribuye a Peyton Rous (16). En 1911 fue capaz de causar tumores en una determinada raza de pollos mediante filtrados libres de células y derivados de tumores. Es instructivo repetir los propios pensamientos de Rous acerca de su observación: "La primera tendencia sería considerar el agente autoperpetuo en este sarcoma de ave como un organismo parasitario pequeño. La analogía con algunas enfermedades infecciosas de hombres y de los animales inferiores, causadas por organismos ultramicroscópicos, da apoyo a esta visión de los descubrimientos, y en la actualidad el trabajo está siendo dirigido hacia su verificación experimental. Pero no debe descartarse un organismo de otro tipo. Es concebible que un estimulante químico, elaborado por las células neoplásicas, pueda causar el tumor en otro huésped y provocar en consecuencia una producción adicional del mismo estimulante"

Los filtros inductores de tumor llegaron a ser conocidos como "virus filtrables" o oncovirus, y más recientemente retrovirus exógenos y retrovirus infecciosos (17). En los años 50, en cultivos de animales y en tejidos frecos, especialmente en tejidos de tumor, las partículas más tarde atribuidas a los retrovirus fueron detectables sin problemas con microscopia electrónica (ME). En 1970, se descubrió en los oncovirus la enzima transcriptasa inversa, que transcribe ARN en ADN. Debido a esto, en los años 70 los oncovirus llegaron a ser conocidos como retrovirus. En la década precedente, se introdujo la centrifugación en gradientes de densidad para separar y aislar partículas subcelulares, incluyendo virus. Debido a que se encontró que algunos constituyentes celulares tenían la misma densidad flotante que los virus, cuando los virus fueran aislados a partir de cultivos celulares, los mejores resultados se podían obtener con fluidos de sobrenadante que tuviesen alta concentración viral y pocos contaminantes celulares. Esto fue satisfecho del mejor modo mediante virus no citopáticos y por condiciones de cultivo que mantuviesen una viabilidad celular máxima. Todos los retrovirus aislados anteriormente al VIH satisfacen las condiciones anteriores (19).

Aprovechando las propiedades retrovirales anteriores, mediante repetidas suspensiones y sedimentación en gradientes de densidad de sacarosa, se podía obtener, a densidad de 1,16 g/ml, una concentración relativamente pura de partículas retrovirales, es decir, obtener partículas retrovirales separadas de todo lo demás, y de este modo aislarlas (19). Sin embargo, como señalaron muchos eminentes retrovirólogos, podría no evitarse la contaminación de la preparación viral con partículas que contienen RT, pero que podrían no ser nada más que "fragmentos celulares", microsomas de células rotas, "vesículas membranosas que pueden encerrar otros constituyentes celulares, incluyendo ácidos nucléicos", especialmente cuando se inducía una "lisis de células inadvertida" (17,18,19,20). Debido a esto, para probar que el material se concentra a 1,16 g/ml contenía nada más que partículas "sin diferencias aparentes en las apariencias físicas", y que las partículas eran realmente retrovirus, cada preparación de retrovirus fue analizada adicionalmente utilizando los siguientes análisis:

a) física: ME para la cuenta, morfología y pureza del virus;

b) bioquímica: actividad de RT, ARN viral y celular, proteínas totales, análisis con gel de las proteínas y ácidos nucléicos virales y del huésped;

c) biológica: infectividad in vivo y in vitro (19,20).

Dicho de otro modo, el primer paso en el esfuerzo de aislar un retrovirus es la demostración de que:

1. Las partículas vistas en los cultivos se concentran en la banda de 1,16 g/ml;

2. En la banda de 1,16 g/ml están las partículas, y poco más;

3. Se ven partículas "sin diferencias aparentes en las apariencias físicas"


Aislamiento del HTLV-III (VIH)

En el primer artículo de aislamiento de VIH, titulado "Detection Isolation and Continuous Production of Cytopathic Retroviruses (HTLV-III) from Patients with AIDS and Pre-AIDS" (6), Popovic, Gallo y sus colegas describieron en primer lugar una línea de células T leucémicas, HT. Está línea de células fue expuesta "a fluidos de cultivo concentrados recolectados de cultivos de corto plazo de células T ... obtenidas de pacientes con sida o pre-sida. Se mostró primero que los fluidos concentrados contienen RT asociado a partícula". Se consideró como prueba de la existencia en estos cultivos de un retrovirus, que fue llamado HTLV-III, el encontrar lo siguiente en la línea de células HT, así como en 8 clones derivados de la misma, incluyendo H4, H9 y H17: a) RT; b) inmunofluorescencia de células con suero procedente de un paciente de hemofilia con pre-sida, y "antisuero de conejo al HTLV-III". "Se controló durante algunos meses tanto la producción de virus como la viabilidad celular del clon infectado H4 (H4/HTLV-III). Aunque la producción de virus [actividad RT] fluctuó (Fig. 2a), los fluidos de cultivo recolectados y analizados en intervalos de aproximadamente 14 días, mostraron consistentemente actividad RT de partículas [actividad RT en el material que hizo banda a 1,16 g/ml], que ha sido seguida durante unos 5 meses ... De este modo, los datos muestran que esta población de células T en crecimiento permanente puede producir continuamente HTLV-III". El examen de ME del cultivo del clon H4 mostró "la presencia de partículas virales extracelulares".

Algunos de los descubrimientos de la investigación a Gallo son relevantes para los anteriores experimentos:

1. La línea de células HT no fue cultivada con fluidos concentrados procedentes de cultivos de células T de pacientes de sida, como se da a entender en el artículo, sino por fluidos acumulados, el primero de los cultivos individuales de 3 pacientes, y finalmente de los cultivos individuales de 10 pacientes. La investigación a Gallo encontró este procedimiento como "de dudoso rigor científico" Un científico lo describió como "una locura".

2. Según la investigación del OSI, "la afirmación en los artículos publicados de que se mostró "primero" que las muestras segregaban RT, se contradice con las pruebas en los cuadernos de que solamente uno de los tres [cultivos iniciales] fue testeado" (22). En el testimonio que Popovic dio a la investigación, dijo que había acumulado los fluidos de sobrenadantes procedentes de los diez cultivos porque ninguno "individualmente estaba produciendo altas concentraciones de trasncriptasa inversa" (no se proporcionan los niveles de RT).

Sin embargo, es importante notar que la RT se determina mediante la estimación de la incorporación de nucleótidos etiquetados [3H] en el ADN, y es reportado como cuentas por minuto (cpm), siendo reconocido que la radioactividad de fondo, es decir, la radioactividad en la ausencia de infección, puede ser tan alta como 0,4 X 104 cpm (23).

Los anteriores descubrimientos llevan a preguntas adicionales: si el primer HTLV-III fue aislado de cultivos de células HT con sobrenadantes acumulados, entonces ¿cómo fue obtenido el "antisuero de conejo al HTLV-III" para los estudios de inmunofluorescencia?. ¿Cómo fue posible asegurar la especificidad de los antisueros del conejo a un virus antes de que el virus haya sido aislado?. De modo similar, ¿cómo fue posible, antes del aislamiento del virus, verificar que el suero del paciente utilizado para testear material procedente de los cultivos, realmente interactuaba especificamente con el mismo virus?

El OSI encontró que la afirmación de que "el cultivo" estaba continuamente produciendo HTLV-III (actividad RT) era incorrecta, ya que el cultivo fue "reinoculado en al menos dos ocasiones" con más sobrenadante (11,22).

En el segundo artículo (7), los autores describen su intento de aislar el HTLV-III a partir de cultivos de células T estimuladas mitogénicamente obtenidos de 115 pacientes con sida, pre-sida y hombres homosexuales clínicamente normales. En la Tabla I, titulada "Detección y Aislamiento del HTLV-III de pacientes con sida y pre-sida", exponen: "Se consideraron positivas las muestras exhibiendo más de uno de los siguientes: detección repetida de actividad de transcriptasa inversa dependiente de Mg2+ en fluidos de sobrenadante; virus observados mediante microscopía electrónica [partículas retrovirales en los cultivos]; expresión intracelular de antígenos relacionados con el virus, detectados con anticuerpos de donantes seropositivos, o con antisuero de conejo al HTLV-III; o transmisión de partículas". Mediante transmisión de partículas se quiso decir detección de transcriptasa inversa o partículas en cultivos de "sangre de cordón umbilical humano, médula ósea, o linfocitos T de sangre periférica", cultivados con fluidos concentrados procedentes de los cultivos celulares de tejidos obtenidos de pacientes de sida. En experimentos adicionales (8,9):

1. Se testearon lisados de líneas de células "infectadas" H4/HTLV-III y H17/HTLV-III, con sueros de pacientes utilizando la técnica Western blot (WB) [pie de nota 1];

2. "Se estudió la especificidad de estas reacciones [para el HTLV-III] mediante la comparación de los lisados de H4/HTLV-III y H17/HTLV-III con lisados de los mismos clones, H4 y H17, antes de la infección viral (Fig. 2A). Ningún antígeno de los clones no infectados reaccionaron con los sueros, con la excepción de una proteína con un peso molecular de 80.000 en el H17, que se unió con anticuerpos de todas las muestras humanas testeadas". Concluyeron: "Estos resultados muestran claramente que los antígenos detectados tras la infección del virus son proteínas codificadas de virus o bien antígenos celulares inducidos específicamente por la infección".

3. La reacción con los sueros de paciente de las células H4/HTLV-III se comparó entonces con la reacción del material de los fluidos de cultivo H4/HTLV-III que en gradientes de densidad de sacarosa se concentran a 1,16 g/ml. Se encontró que dos de las proteínas que se concentraron a 1,16 g/ml, la p41 y la p24, reaccionaban con algunos sueros del paciente. Concluyeron: "la p24 y la p41 podrían por tanto ser consideradas proteínas estructurales virales";

4. Finalmente, utilizaron la técnica ELISA [pie de nota 2] para testear en busca de anticuerpos al HTLV-III. 88% (43 de 49) de pacientes con sida, y 79% de pacientes con pre-sida (11 de 14), pero "menos del 1 por ciento de individuos heterosexuales" tuvieron anticuerpos "reactivos contra antígenos del HTLV-III". "Para comprender la naturaleza molecular de los antígenos reconocidos por el ELISA", los sueros fueron analizados mediante el WB. "... el antígeno más prominente y comúnmente detectado entre todos los sueros de las pacientes de sida tuvo un peso molecular de 41.000 (p41) ... La reactividad a la p24 del virus fue generalmente muy débil y fue clara solamente en dos casos".

De los datos anteriores es obvio que por aislamiento del HTLV-III (VIH) se entendió la detección de más de uno de los siguientes fenómenos:

1. RT, bien en fluidos de cultivo, o en el material procedente de estos cultivos o lisados celulares, que en gradientes de densidad de sacarosa se concentra en la banda a 1,16 g/ml;

2. En fluidos de cultivo, pero no en el material que se concentra en la banda de 1,16 g/ml, partículas con características morfológicas de los retrovirus (RVP);

3. Proteínas (p41 y, en algunos casos, p24) que en gradientes de densidad de sacarosa se concentran en la banda de 1,16 g/ml (pero sin pruebas de que sean las partes constituyentes singulares de la partícula), y reaccionan con los sueros del paciente;

Sin embargo, aislamiento se define como separar un objeto (VIH) de todo lo demás, y no la detección de algunos fenómenos atribuidos a ello (RT, WB), o similares a ello (RVP). Los fenómenos sólo pueden usarse para detección de retrovirus, no aislamiento, e incluso así sí, y solamente sí, se muestra que cada uno es específico al virus mediante el uso del único estándar oro válido, el VIH en sí mismo, "el aislamiento del VIH". Es importante notar que en el anterior (1983) artículo del grupo de Montagnier sobre el aislamiento del VIH (LAV), se informó de los mismos procedimientos experimentales y descubrimientos que los descritos por Gallo. La única excepción es que el grupo de Montagnier no "infectó" una línea de células inmortalizada, aunque el grupo de Gallo consideró que Montagnier y sus colegas no habían descrito un "aislamiento verdadero" (6). De hecho, en 1984, había datos acerca de que la RT, las reacciones antígeno-anticuerpo (WB), y las RVP no son específicas de los retrovirus. Los datos indirectos, es decir, los datos que se han obtenido sin un estándar oro, de la investigación reciente del sida han confirmado lo anterior.


Transcriptasa inversa

Aunque Gallo describió la enzima transcriptasa inversa como "singular de los retrovirus", no es cierto, un hecho enfatizado por sus descubridores (ambos premios Nobel) (17). La transcriptasa inversa se puede encontrar en células T leucémicas (24) (la HT y sus clones, incluyendo el H9, de donde "se aisló el primer virus HTLV-III", es una línea de células leucémica), espermatozoides normales (25) y, según Harold Varmus, otro premio Nobel, más recientemente, en las células no infectadas de levaduras, insectos y mamíferos (26). Ya en 1973, el propio Gallo fue el primero en mostrar que la RT se podía encontrar en "linfocitos de sangre humana normales estimulados con PHA (pero no dejados de estimular) (24). Esto se confirmó en la conferencia del sida de Florencia de 1991, donde se presentaron datos de que el fármaco AZT podía inhibir la acción de RT normal celular (27), y esto fue propuesto como un mecanismo de la toxicidad del fármaco.


Partículas retrovirales

Por definición, las partículas retrovirales son partículas infecciosas con envoltura de 100 a 120 nm de díametro con un núcleo compuesto de una cubierta de proteínas y un complejo de ribonucleoproteína. De modo adicional, las RVP se clasifican según el sitio de ensamblaje del núcleo, bien sea dentro del citoplasma o en la membrana de la célula, así como por otras características morfológicas. En esta taxonomía se incluyen las subfamilias de Oncovirus, en donde se tienen las partículas tipo C y tipo D, así como la subfamilia de Lentivirus.

Antes de la era del sida, muchos retrovirólogos mostraron que el encontrar una partícula con características morfológicas similares a los retrovirus no constituye una prueba suficiente de que son retrovirus, de que son partículas infecciosas, ni siquiera si se concentran en la banda de 1,16 g/ml (18). En 1976 el propio Gallo señaló que en tejidos leucémicos humanos "se han observado frecuentemente partículas con aspecto viral, morfológicamente y bioquímicamente parecidas a los virus tipo C, pero aparentemente sin la habilidad de replicarse" (28). Se informó de partículas con las características morfológicas de los retrovirus en la leche, cultivos de tejidos de embriones, y "en la mayoría, sino todas, las placentas humanas" (29,30,31). Sin embargo, fueron consideradas como un "misterioso e importante problema que permanece sin resolver" (32). Los datos de la investigación del sida muestran que:

1. No hay acuerdo en la clasificación taxonómica concreta del VIH. Inicialmente, se informó del VIH como una partícula Oncoviral tipo C , después como una partícula tipo D (33), y finalmente como un miembro de una subfamilia diferente, un Lentivirus (34);

2. Las células T y monocitos de "cultivos infectados con VIH" contienen, además de partículas con morfologías atribuidas al VIH, muchas otras "particulas virales" diferentes a cualquiera de las "partículas de VIH" (35,36,37,38). Las células HT (H9) "no infectadas con VIH", la línea de células a partir de la cual el equipo de Gallo "aisló" el primer VIH (HTLV-III), y de la cual se han originado la mayoría de micrografías electrónicas de "partículas de VIH", así como otras células utilizadas para el "aislamiento del VIH", CEM, C8166, células B transformadas con EBV, y linfocitos de cordón umbilical, expresan partículas con aspecto viral, aunque son algo diferentes de la variedad de partículas aceptadas como VIH (39). Estos datos lleva a preguntas no solamente en referencia al origen y papel de las "partículas que no son de VIH", sino también al de las "partículas de VIH (HTLV-III)". Además, ni el equipo de Gallo ni nadie más desde entonces ha publicado micrografías ME del material derivado de cultivos-cocultivos de sida que se concentra a 1,16 g/ml. De este modo es imposible conocer cuáles, si alguna de las partículas, se concentran a esa densidad.

3. Más importante, es generalmente aceptado que las partículas reportadas en los ganglios linfáticos de pacientes de sida son VIH. Sin embargo, en el único estudio ME (40), in vivo o in vitro, en que se utilizaron controles adecuados, y en que se realizó un análisis ciego extenso de los controles y el material de test, las "partículas de VIH" se encontraron en 90% (18 de 20) de los pacientes con linfadenopatía generalizada persistente atribuida al VIH, y en 87% (13 de 15) de los pacientes con "linfadenopatías que no son del VIH", llevando a los autores a concluir: "La presencia de tales partículas no indican, por sí mismas, infección con VIH".


Reacciones antígeno-anticuerpo

Se puede afirmar que una determinada proteína es un antígeno derivado de un retrovirus exógeno si primero se muestra que:

1. La proteína es el componente estructural de una partícula;

2. La partícula es un retrovirus;

3. La proteína está codificada exclusivamente por un gen viral, y no uno celular.

Una vez que esto se ha demostrado, el único modo de demostrar que los anticuerpos encontrados en los sueros del paciente de sida están dirigidos contra el antígeno viral es utilizar el antígeno o el virus aislado como estándar oro. La mera constatación de que una proteína de los cultivos de sida se concentra en la banda de 1,16 g/ml y reacciona con los sueros de pacientes de sida no puede considerarse que pruebe al mismo tiempo que:

1. La proteína sea un antígeno viral;

2. Los anticuerpos en los sueros del paciente de sida que reaccionan con el antígeno sean específicos para ese antígeno.

En la actualidad, se sabe que sobre el 80% de las proteínas que se concentran a 1,16 g/ml, algunas de las cuales reaccionan con algunos sueros de sida, no constituyen ninguna de las proteínas atribuidas al VIH (41,42,43). Más importante, antes de la publicación de los artículos de Science, existían datos, confirmados desde entonces, que no concuerdan con la conclusión de que las proteínas "p24 y p41 puedan por tanto considerarse proteínas estructurales virales".


La proteína p41/p45

En la investigación del sida, se considera que las bandas p41 y p45 representan una misma proteína del VIH.

1. Como el grupo de Gallo, el grupo de Montagnier encontró, un año antes, que los sueros de sida reaccionaban con una proteína p41/p45 procedentes de los cultivos de sida, y que en gradientes de densidad de sacarosa se concentraba a 1,16 g/ml. Sin embargo, de sus datos consideraron que la banda p41 "podía ser debida a contaminación del virus con actina celular, que estaba presente en inmunoprecipitados de todos los fragmentos de celulas" (5), es decir, de células "infectadas con VIH" así como células no infectadas, y también células infectadas con HTLV-I. Aunque el grupo de Gallo no encontró tal reacción con la p41 en células no infectadas, encontraron una proteína p80 y concluyeron que la reacción era "no específica" (8). Sin embargo, se sabe que la p80, así como dos proteínas del "VIH" adicionales, p120 y p160, son oligómeros de la p41 (44). La proteína (banda) que se detecta en un determinado WB, la p41, p80, p120 o p160, depende del cultivo y las condiciones del WB, incluyendo la temperatura y la concentración de dodecilsulfato sódico utilizado para alterar las proteínas que se concentran a 1,16 g/ml (45);

2. La actina es una proteína omnipresente, presente en todas las células, y también en bacterias y algunos virus. Se ha mostrado también que retrovirus bien conocidos, como el virus de tumor mamario de ratón, contienen actina de origen celular, y se ha propuesto que esta proteína juega un papel crítico en el ensamblaje y gemación de los retrovirus (46,47);

3. Las plaquetas de individuos sanos también contienen una proteína p41 que reacciona con los sueros de hombres homosexuales con sida y púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), y que "representa una unión no específica de IgC a la actina en la preparación de plaqueta" (48).

4. Investigadores del Instituto Pasteur mostraron que los sueros de pacientes de sida y grupos de riesgo del sida contienen niveles altos de anticuerpo contra actina de músculo estriado de cordero (49).


La proteína p24/p25

1. Aparte de una publicación conjunta con Montagnier, donde afirman que la proteína p24/p25 del VIH es única, Gallo y sus colegas han expuesto repetidamente que las proteínas p24 del HTLV-I y el VIH reaccionan de modo cruzado inmunológicamente (50); 2. Genesca et al. (51) llevaron a cabo ensayos de WB en 100 muestras ELISA negativas de donantes de sangre sanos; se encontró que 20 tenían bandas de VIH que no cumplían con los criterios (1989) entonces utilizados por los bancos de sangre para un WB positivo. Fueron consideradas como WB indeterminados (WBI), siendo la p24 la banda predominante (70% de los casos). Entre los receptores de sangre WBI, 36% fueron WBI 6 meses después de la transfusión, pero también lo fueron 42% de los individuos que recibieron muestras negativas de WB. Tanto los donantes como los receptores de sangre permanecieron sanos. Concluyeron que los patrones WBI "son excesivamente comunes en donantes y receptores seleccionados aleatoriamente, y tales patrones no correlan con la presencia de VIH-1 o la transmisión de VIH-1", "la mayoría de esas reacciones representan resultados de falsos positivos";

3. Se han detectado anticuerpos a la p24 en 1 de cada 150 individuos sanos, en 13% de pacientes seleccionados aleatoriamente, con verrugas generalizadas, el resto sanos, en 24% de pacientes con linfoma cutáneo de células T y pródomo, y en 41% de pacientes con esclerosis múltiple (52);

4. 97% de sueros de homosexuales con ITP y 94% de sueros de homosexuales con linfadenopatía o sida contienen un anticuerpo que reacciona con un antígeno de membrana 25 Kd encontrado en plaquetas de donantes sanos y pacientes de sida, así como con un antígeno 25 Kd encontrado en células de riñón de monos verdes, fibroblastos de piel humana, y herpes simple cultivado en células renales de monos. Esta reacción no existió en sueros obtenidos de pacientes no homosexuales con ITP o no ITP (48);

5. En cambio, el antígeno p24 no se encuentra en todos los positivos VIH o incluso en pacientes de sida. En un estudio, se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la p24 para detectar el VIH en pacientes en varias etapas CDC, desde asíntomáticos a sida. Se detectó la p24 en el 24% de los pacientes, y el ARN de VIH en el 50% (53);

6. En otro estudio, "en la mitad de los casos en los que un individuo tuvo un test p24 positivo, el individuo tuvo más tarde un test negativo sin tomar ninguna medicación que se esperara que afectara a los niveles del antígeno p24 ... el test es clínicamente imprevisible y debería interpretarse con mucha cautela" (54). De este modo, el encontrar partículas virales en cultivos-cocultivos de sida, RT y proteínas que reaccionan con sueros relacionados con el sida, en el material derivado del sobrenadante o lisados de célula que en gradientes de densidad de sacarosa se concentra a 1,16 g/ml, no puede considerarse sinónimo de aislamiento de un retrovirus, ni siquiera de detección de un retrovirus. Incluso si un retrovirus es aislado en cultivos-cocultivos in vitro procedentes de tejidos de pacientes de sida, esto no constituye por sí mismo una prueba de la existencia de un virus in vivo (en pacientes de sida), y mucho menos que se haya adquirido de modo exógeno. Esto es debido a que:

1. En la actualidad, se acepta generalmente que "una de las características más llamativas que distingue a los retrovirus de todos los otros retrovirus animales es la presencia, en los cromosomas de células normales no infectada, de genomas [provirus] estrechamente relacionados con, o identicos con los de virus infecciosos". El genoma humano, además de otras secuencias provirales, es conocido por contener secuencias del HTLV-I (55,56) y del VIH (57). Dependiendo de las condiciones, el genoma proviral permanece sin expresar, o parte o todo él puede expresarse. Lo último puede o puede no llevar al ensamblaje de partículas virales (retrovirus endógeno) (17). En cultivos animales, las células sanas que no producen virus tarde o temprano liberan retrovirus espontáneamente (20). La aparición y producción se puede incrementar mediante i) estimulación mitogénica (58); ii) técnicas de cocultivación (59); iii) cultivo de células con sobrenadante a partir de cultivos que no producen virus (60). Según un eminente retrovirólogo, George Todaro, "el fracaso en aislar virus endógenos procedentes de ciertas especies podría reflejar las limitaciones de las técnicas de cocultivación in vitro"; (61). 2. El equipo de Gallo, como todos los demás: i) "aislaron el HTLV-III (VIH)" a partir de cultivos de células; ii) "aislaron el HTLV-III" a partir de cultivos de células estimulados y activados mitogénicamente;

3. Además, Gallo y sus colegas también usaron técnicas de cocultivación;

4. El primer "aislamiento HTLV-III" fue derivado de la línea de células HT (H4, H9, H17). Leyendo el primer artículo de Gallo y sus colegas, se supone que la línea de células HT se estableció en el laboratorio de Gallo. La investigación a Gallo reveló que la línea de células HT es de hecho la HUT78, una línea de células establecida en otro laboratorio a partir de un paciente con leucemia de células T4 maduras, una enfermedad que Gallo afirma que está causada por un retrovirus exógeno, el HTLV-I (3). Si es así, entonces todos los cultivos de células HT, y los clones derivados de ellos, "infectados con HTLV-III" o no infectados, y el material procedente de estos cultivos que se concentra a 1,16 g/ml, debería contener el HTLV-I (1), y por tanto RT y partículas retrovirales. Además, puesto que sobre el 25 % de los pacientes de sida tienen anticuerpos al HTLV-I (1), y las proteínas inmunogénicas del HTLV-I y el VIH tienen los mismos pesos moleculares, entonces aproximadamente el 25% de los cultivos HT (H4, H9, H17) no infectados, además de la RT y partículas, deberían tener en el Western blot, las mismas bandas que aquellos de los cultivos "HTLV-III infectados". De este modo, estos WB's saldrán errononeamente positivos al HTLV-III.


Prueba de que el HTLV-III (VIH) está causalmente vinculado al sida

Gallo afirma, una afirmación aceptada por la gran mayoría de los investigadores del sida, que en los artículos de Science de 1984 él y sus colegas presentaron "claras pruebas de que este [virus] y esto solamente era la causa del sida" (62). Un requisito mínimo para hacer tal afirmación debería ser la presentación de las siguientes pruebas:

1. Que todos los pacientes de sida están infectados con el HTLV-III;

2. Que la infección con HTLV-III lleva a la disminución de las células T4, si se asume que el HTLV-III lleva al síndrome clínico mediante su citotoxicidad de T4.

Las pruebas para la existencia del HTLV-III fueron el "aislamiento del virus" y los tests de anticuerpos ELISA. Incluso si se asume que los datos presentados representan "aislamiento verdadero", el virus fue aislado en menos de la mitad (10 de 21) de los pacientes de sida infectados con infecciones oportunistas, y en menos de un tercio (13 de 43) con sarcoma de Kaposi, entonces y en la actualidad las dos enfermedades de sida más características. Incluso si el virus pudiese haber sido aislado en todos los pacientes, dada la naturaleza de los retrovirus y el método utilizado para el aislamiento del HTLV-III (cultivos, estimulación mitogénica, cocultivación), no se puede excluir la posibilidad de que el virus no existiese in vivo (en pacientes de sida), y que fuese un provirus cuya expresión se facilitara por las condiciones del cultivo. El único método utilizado para probar la infección por VIH in vivo fueron los tests de anticuerpos. Tal test sólo puede ser utilizado una vez que su especificidad haya sido probada mediante el uso del único estándar oro posible, el virus en sí mismo. Esto no se ha realizado.

Además, el test de anticuerpos utilizado por Gallo fue el ELISA, conocido en la actualidad por ser no reproducible y no específico. En un estudio de 1,2 millones de aspirantes militares sanos, conducido por el coronel Donald Burke y sus colegas (63), se encontró que, aunque aproximadamente un 1% de todos los individuos tenían un ELISA al VIH inicial positivo, sólo el 50% de los ELISA's repetidos fueron positivos. De estos últimos, sólo aproximadamente un tercio se asociaron con dos WB's positivos posteriores. En Rusia, en 1990, de 20.000 ELISA's positivos "sólo 112 fueron confirmados" utilizando el WB como estándar oro. En 1991, de aproximadamente 30.000 ELISA's positivos, solamente se confirmaron 66 (64).

En ningún sitio de los cuatro artículos de Science se menciona la citotoxicidad del HTLV-III. La única referencia a alguna abnormalidad celular o patología en general es en el primer artículo, donde se puede leer: "Los cultivos positivos al virus mostraron consistentemente una alta proporción de celulas gigantes redondas conteniendo numerosos núcleos (Fig. 1a). Estas células se parecen a aquellas inducidas por el HTLV-I y II, excepto que los núcleos exhiben una formación en anillo característica". (La Fig 1a es un "examen microscópico de luz del clon H4/HTLV-III"). El clon H4 se obtuvo de la línea de células HT "utilizando células mononucleares irradiadas procedentes de sangre periférica de un donante de sangre sano como alimentador". En la actualidad, se sabe que la línea de células HT, y por tanto la H4, son HUT78, derivada en 1980 de un paciente con leucemia de células T4 maduras (65,66). Sin embargo, se conoce que otras líneas de células derivadas de pacientes con el mismo síndrome clínico exhiben morfologías similares, incluyendo células gigantes multinucleadas (67). De este modo, las características morfológicas celulares observadas en el primer artículo podrían haber sido una propiedad intrínseca de la línea de células HT, o el resultado de las condiciones del cultivo, o ambas, y no debido al HTLV-III. Finalmente, Gallo y sus colegas no proporcionaron ningún dato del estado inmunológico de los individuos en los que se intentó el aislamiento, y no se presentó ningun dato que probara que:

1. El HTLV-III (VIH) sea necesario y suficiente para causar la disminución de células T4.

2. La disminución de células T4 sea necesario y suficiente para la aparición de las enfermedades indicadoras de sida.


Conclusiones

Los datos y argumentos que fueron presentados por Gallo y sus colegas no constituyen prueba del aislamiento del VIH ni de un papel no ambiguo del VIH en la patogénesis del sida. Aunque algunos investigadores utilizan en la actualidad métodos de "aislamiento de virus" esencialmente iguales a los descritos por el grupo de Gallo, la mayoría utilizan métodos menos rigurosos, incluyendo solamente la detección de p24 (mediante técnicas de anticuerpos), o de RT. Sin embargo, con todas estas técnicas, incluyendo las descritas por Gallo y sus colegas, que en sí mismas se ve que son muy problemáticas, el VIH no puede ser "aislado" en el 20 a 70% de los pacientes VIH positivo y de sida (68,69). De este modo nos encontramos ante un problema de considerable importancia. Los tests de anticuerpos del VIH, el ELISA y el WB, los únicos tests utilizados rutinariamente para probar la existencia in vivo del VIH, tienen todavía que verificarse contra el único estándar oro adecuado, el aislamiento del virus. Los datos disponibles sugieren que este muy atrasado pero más básico requisito de evaluación del test, es probable que constituya un problema inmenso, y mientras los tests de anticuerpos del VIH son unos marcadores de pronóstico útiles en los grupos de alto riesgo, su uso como herramientas de diagnóstico y epidemiológicas de la infección por VIH es cuestionable.*


Apéndices

Apéndice 1. En el test Western blot, las proteínas se separan meiante electroforesis según el peso molecular y la carga. Las proteínas separadas se transfieren entonces a tiras de nitrocelulosa en un proceso conocido como electrotransferencia. Cuando se añaden los sueros y se desarrollan las tiras, aparecen bandas coloreadas que representan sitios de reacciones de proteínas-anticuerpos. Cada banda se designa con una "p" pequeña para la proteína, seguida por su peso molecular en miles.

Apéndice 2. En el ELISA (Ensayo de Inmunoabsorción Ligado a Enzimas), las proteínas sin separar se unen a una base sólida, tan como las paredes de tubos de plástico o microplacas. El suero que se examina se incuba en estos contenedores, donde el anticuerpo se fija a los antígenos en fase sólida. Después del lavado, se añade y se incuba inmunoglobina antihumana de marcado de enzima. Los contenedores se lavan de nuevo y se introduce un sustrato específico de la enzima. El cambio de color resultante es proporcional a la cantidad de anticuerpo presente y se lee a ojo, mediante un espectrofotómetro.


Agradecimientos

Nos gustaría expresar nuestro agradecimiento a todos nuestros colegas, especialmente a Udo Schklenk, Barry Page, Bruce Hedland-Thomas, David Causer, Richard Fox, John Peacock, David Prentice, Ronald Hirsch, Patricia Shalala, Keith Jones, Alun Dufty, June Rider Jones, Coronary Barrow, Dorothy Davis, Julian Smith, Mark Strahan, Vincent Turner, Wallace Turner, Gary James y Graham Drabble por su continuo apoyo y ayuda.


Eleni Papadopulos-Eleopulos, Physicist

Department of Medical Physics

Royal Perth Hospital


Valendar F. Turner, Staff Specialist

Department of Emergency Medicine

Royal Perth Hospital


John M. Papadimitriou Professor of Pathology

Department of Pathology

University of Western Australia


Correspondence to:

Eleni Papadopulos-Eleopulos

Department of Medical Physics

Royal Perth Hospital

Box X2213 GPO Perth


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(Aceptado: 2 abril de 1993)