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Podríamos preguntar ... ¿se ha seguido el modo "correcto" de aislar el VIH? Para responder se hace necesario comprender el significado de "aislamiento", y por qué este término aparece de manera tan prominente en la literatura virológica [1]. En el uso diario, "aislamiento" se refiere a un objeto que se separa de todo lo demás. Por ejemplo, la luna en el cielo, un prisionero llevado a un confinamiento solitario, un paciente con fiebre tifoidea sacado de la sala general y llevado a una habitación individual. O Marie y Pierre Curie extrayendo la décima parte de un gramo de cloruro de radio de una tonelada de pechblenda facilitada a ellos por el gobierno austriaco. De modo significativo, aunque apenas nos damos cuenta del hecho, confirmamos la existencia de un objeto porque dicho objeto está, o podemos hacerlo estar, separado del resto del universo. Por tanto el aislamiento es un método para probar la existencia de un objeto, incluyendo objetos hasta la fecha desconocidos. Así es como eran las cosas en 1983, dos años después de que el sida apareciese. Los científicos estaban buscando un objeto que no se sabía que existiese con anterioridad, que plantearon la hipótesis de que era un retrovirus nuevo y que infectaba a los humanos.
Casi no hace falta decir que en el sentido que se ha expuesto, los métodos de laboratorio utilizados por los virólogos para el "VIH" no son aislamiento. Ningún virólogo ha conseguido nunca con cultivos de células de pacientes de sida lo que Curie hizo con su tonelada de pechblenda. Sin embargo, puesto que los virólogos creen que sus métodos llevan a probar la existencia de un virus, se ha convertido en tradición considerar a estos métodos como "aislamiento". Es decir, la palabra aislamiento como "forma taquigráfica" para este conjunto de procedimientos [2]. El problema que hay que abordar no es la semántica, sino si los métodos aplicados a los cultivos de células derivados de pacientes de sida prueban la existencia de un retrovirus VIH. ¿Si o no? Esta es la pregunta que hemos abordado en muchos de nuestros artículos, y que más recientemente hemos pedido varias veces en el debate de The British Medical Journal.
Según dos insertos del kit de test de anticuerpos elegidos aleatoriamente [3], el VIH fue aislado en pacientes de sida en 1983-84 por Montagnier, Gallo y sus colegas. Durante los últimos 20 años, se ha citado repetidamente a sus artículos iniciales de Science como prueba de ello. El propio Gallo considera a estos documentos como evidencia clara de la existencia del VIH y su papel causal en el sida. Por lo tanto, un análisis de estos importantes trabajos debería confirmar que los métodos y los datos reportados constituyen la prueba del "aislamiento" de un retrovirus VIH. Y debido a que Montagnier y Gallo utilizaron esencialmente la misma metodología, que solamente difiere en el número de pacientes reportados, podemos examinar sus métodos y datos simultáneamente.
La Tabla 1 del segundo artículo de Science de Gallo [4] define "Detección y aislamiento de HTLV-III [HIV] a partir de pacientes de sida y pre-sida" en cultivos de células, como "Muestras que presenten más de uno de lo siguiente":
1. "... actividad de transcriptasa inversa [RT] en fluidos de sobrenadante". (El sobrenadante es el líquido encima del sedimento tras la centrifugación. Se dice que las partículas retrovirales se liberan de las células infectadas y se recolectan en el sobrenadante).
2. "virus observado mediante microscopía electrónica".
3. transmisión de partículas, detectadas mediante ensayos RT o mediante observaciones de microscopía electrónica, a sangre de cordón [umbilical] humano fresco, a la médula ósea, o a linfocitos T de sangre periférica".
4. "expresión [producción] intracelular de antígenos [proteínas] relacionados con el virus, detectados con anticuerpos de donantes seropositivos, o con antisuero de conejo al HTLV-III [VIH]".
COMENTARIOS
1. "... actividad de transcriptasa inversa [RT] en fluidos de sobrenadante".
La transcriptasa inversa es una enzima característica de los retrovirus, pero que no se limita a los retrovirus. Es de interés la razón de "retro" en los retrovirus. Es debido a que la enzima RT transcribe (copia) a ADN la información contenida en una secuencia de ARN. Esta dirección se consideraba anteriormente como "opuesta" al flujo "normal" de la información en la materia viva (ADN --> ARN --> proteínas). Puesto que la RT es solamente una característica de los retrovirus (como lo es el pelo en los mamíferos), no puede considerarse prueba de la detección o aislamiento de un retrovirus más que el encontrar pelo prueba que un animal fuera una especie clasificada, o un conejo fuera el único animal en el zoológico. Según el descubridor de la enzima, Howard Temin, la RT está presente en todas las células. Los linfocitos normales, estimulados con el mismo agente químico necesario para "aislar" el VIH a partir de cultivos de células, también retrotranscriben ARN en ADN. El propio Gallo probó esto en 1973 [5]. Las células normales también poseen enzimas retrotranscriptoras que no son RT.
2. "virus observado mediante microscopía electrónica".
El visualizar partículas con las apariencias de los retrovirus no prueba que tales partículas sean retrovirus. El propio Gallo sabía esto en 1976, ver la Pregunta 3. Considerar a estas partículas como "virus" es poner el carro delante del caballo. Las partículas que Gallo y Montangnier reportaron como VIH en sus artículos iniciales son partículas retrovirales tipo C, no partículas lentivirales, que es la taxonomía de las partículas del "VIH". Si ni Gallo ni Montagnier encontraron partículas de lentivirus, ¿cómo pueden sus artículos considerarse como prueba del aislamiento del VIH? ¿Y cuál es el origen y el papel de las partículas tipo C que encontraron? ¿Son éstas un retrovirus? ¿Causan el sida?
3. transmisión de partículas, detectadas mediante ensayos RT o mediante observaciones de microscopía electrónica, a sangre de cordón [umbilical] humano fresco, a la médula ósea, o a linfocitos T de sangre periférica".
La aparición de actividad de RT o de partículas, incluso en mil cultivos, no altera el hecho de que no son manifestaciones específicas de los retrovirus. Y aunque Gallo escribió "partículas, detectadas mediante ensayos RT", esto implicaría el purificar tales partículas para probar que la actividad RT era una propiedad singular de esas partículas. No se publicó ningún dato de tal purificación de partículas. En toda la investigación del sida no se tienen datos acerca de la purificación de ninguna partícula, incluyendo aquellas que se consideran como el VIH.
4. "expresión [producción] intracelular de antígenos [proteínas] relacionados con el virus, detectados con anticuerpos de donantes seropositivos, o con antisuero de conejo al HTLV-III [VIH]".
Expresión de "antígenos relacionados con el virus" [6]. "Expresión" es una palabra de jerga virológica que conserva el uso común, significando "transformar ideas en palabras". Pero en virología, lo que está siendo transformado es la información ("ideas") almacenadas en un ADN (o ARN) viral, no en palabras sino en proteínas o partículas virales. De este modo, "expresión" significa la producción por la maquinaria biológica celular de proteínas virales, basada en la información contenida en un segmento de ADN o ARN viral. Este es el mismo proceso bioquímico que ocurre en células normales sanas no infectadas con un virus, pero que utilizan el ADN celular para producir proteínas celulares. Por convención, bajo esta circunstancia a este proceso no se le conoce como "expresión". Por tanto, cada vez que un virólogo utiliza la palabra "expresión", está afirmando la existencia de proteínas producidas por la célula bajo la dirección de un virus. Sin embargo, puesto que los experimentos de cultivo celular fueron llevados a cabo con el fin de demostrar la existencia de un virus, es poco científico y engañoso referirse a tales proteínas como virales.
"Antígenos relacionados con el virus" "detectados con anticuerpos" significa un test de anticuerpos. Dado que Montagnier y Gallo eran muy conscientes de que la RT y las partículas son hallazgos no específicos, debemos concluir que el "aislamiento del VIH" equivale a nada más que un test de anticuerpos. De hecho, Gallo confirmó esto durante una entrevista con Huw Christie en la 12ª Conferencia Internacional del Sida mantenida en Ginebra, en 1998. Si bien estas proteínas son, sin duda, antigénicas en algunas especies de animales, es imposible inferir de una reacción de anticuerpos que sean "no humanas" o "virales", y por tanto extrañas y antigénicas en humanos (sobre todo porque ahora sabemos que las proteínas del "VIH" se encuentran en células "no infectadas con el VIH"). Tampoco se puede inferir que sean los antígenos responsables de los anticuerpos encontrados en los "donantes seropositivos", y que esos anticuerpos estén dirigidos contra esas proteínas. Esos anticuerpos pueden surgir por razones que no tienen nada que ver con esas proteínas o una infección viral, sino simplemente reaccionar cruzadamente con las proteínas. Especialmente teniendo en cuenta que, a pesar de ser "deficientes inmunes", los pacientes de sida tienen generalmente altos niveles de todos los anticuerpos. Incluso si las proteínas fuesen "virales" los anticuerpos todavía podrían ser de reacción cruzada. Incluso si las proteínas fuesen proteínsa celulares normales todavía podrían ser de reacción cruzada o "autoanticuerpos". Estos últimos son anticuerpos dirigidos contra componentes celulares, incluyendo proteínas, y hay una gran cantidad de tales anticuerpos en pacientes de sida. La presunción de que los anticuerpos deben estar específicamente dirigidos contra ciertos "antígenos relacionados con el virus" no se puede justificar con ningún dato de los artículos de Gallo y Montagnier. De hecho, hasta la fecha no hay datos en ningún artículo que sostengan la existencia de anticuerpos dirigidos contra un retrovirus "VIH" en nadie. Ver la Pregunta 5 y [7-8].
"Antisuero de conejo al HTLV-III [VIH]" significa anticuerpos dirigidos contra las proteínas del VIH presentes en el suero de conejo. Puesto que los conejos no desarrollan sida ni la infección con VIH, el único modo de producir tales anticuerpos es inmunizar (inyectar) a los conejos con el VIH, así como se inmuniza a los niños contra la polio o el sarampión inyectándoles virus de la polio o del sarampión (atenuado o inactivado). Según el primer artículo de Science de Gallo, el "anticuero de conejo" se llevó a cabo "infectando a los conejos repetidamente con HTLV-III [VIH] alterado". Sin embargo, para obtener las proteínas de "HTLV-III alterado", primero se debe:
(a) probar que las supuestas partículas de VIH son un retrovirus;
(b) purificar las partículas de VIH con el fin de separar las proteínas "alteradas del HTLV-III" de las proteínas celulares;
(c) probar que las reacciones entre las proteínas "alteradas" y los anticuerpos que inducen en conejos son específicas (los anticuerpos de conejo podrían reaccionar de forma cruzada con "otras" proteínas celulares "que no son del VIH"; por otra parte, las proteínas celulares "que no son del VIH" inyectadas a los conejos inducirán anticuerpos que reaccionan con las mismas proteínas. Si los datos de "antisuero de conejo" prueban que ciertas proteínas son retrovirales, entonces todas las proteínas pueden probarse como retrovirales).
Hasta la fecha no hay datos en favor de (a), (b) o (c).
Todo lo que Gallo y sus colegas pudieron observar en su experimento resuelve el cuarto criterio a:
"En cultivos celulares derivados de pacientes de sida, algunas proteínas reaccionan con algunos anticuerpos presentes en el suero de pacientes de sida, o de conejos que han sido inmunizados con proteínas encontradas en estos cultivos celulares".
Sin embargo, Gallo y sus colegas articulan este criterio como:
"En cultivos celulares derivados de pacientes de sida, se producen proteínas que:
(a) surgen a causa de un ADN viral presente en estas células (este es el significado de "expresión");
(b) son constituyentes de este virus y están "relacionadas" con este virus;
(c) al ser no humanas son extrañas, y por tanto antigénicas;
(d) causan la aparición de anticuerpos de suero que están dirigidos contra ellas, y estos son los anticuerpos detectados en los "donantes seropositivos";
(e) reaccionan con anticuerpos similares producidos mediante la inmunización de conejos con las mismas proteínas [9].
Dado que:
1. La enzima RT no es única de los retrovirus.
2. El proceso de retrotranscripción no es único a la RT o a los retrovirus.
3. Las partículas con las apariencias de los retrovirus no son únicas a los retrovirus, y ni Montagnier ni Gallo encontraron ninguna partícula retroviral de lentivirus en los pacientes de sida.
4. Un científico no puede afirmar la "expresión" de "antígenos relacionados con el virus" en cultivos celulares sin tener prueba previa de que: (a) el virus existe; (b) la célula está infectada con ese virus.
5. Un test de anticuerpos no es aislamiento de virus.
6. El hecho de que las proteínas y los anticuerpos reaccionen no prueba que: (a) las proteínas sean virales; (b) las proteínas sean externas e induzcan la aparición de los anticuerpos; (c) los anticuerpos se encuentren en pacientes de sida; (d) los anticuerpos se dirijan contra las proteínas.
7. Debido a la afirmación de la Tabla 1: "Muestras que presenten más de uno de lo siguiente ...", se puede probar la existencia de un nuevo retrovirus en ausencia de RT, o de partículas, o de proteínas en cultivos celulares de pacientes de sida. Sin embargo, la RT, las partículas y las proteínas son propiedades necesarias de los retrovirus.
Dejamos al lector el contemplar "qué realmente está mal con el modo en que se ha aislado el VIH" (9-13).
Notas:
1. Una búsqueda en PubMed de [virus AND isolation] produce 92.314 artículos. Una búsqueda de [isolation AND bacteria] produce 241.851 artículos.
2. Tanto los textos básicos de virología como los especializados raramente definen "aislamiento", y cuando lo hacen los intentos no son esclarecedores. Por ejemplo, Levy define aislamiento como una "muestra de un virus de una fuente definida" (1), y White como la capacidad de "identificar un virus totalmente imprevisto, o incluso descubrir un agente totalmente nuevo". Bajo el título de "aislamiento de virus" se hace referencia a métodos de cultivo de especímenes en tejidos y células de embrión de pollo, así como animales vivos, seguido de documentación de efectos citopáticos y patológicos, hemoabsorción, inmunofluorescencia, reacciones antígeno-anticuerpo, y "caracterización del genoma viral" (2-5). Los expertos del VIH, incluyendo a Luc Montagnier y Robin Weiss, definen "aislamiento del virus" como el "propagarlos [virus] en células de cultivo (6,7). Si "aislamiento de virus es "tomar una muestra de un virus de una fuente definida" o "propagarlos en células de cultivo", entonces se debe tener conocimiento previo de que existe un virus en "una fuente definida" o "en células de cultivo". Sin embargo, la prueba de que el virus existe en una "fuente definida" o "en células de cultivo", o que puede "propagarse", está supeditado al aislamiento del virus, para que pueda haber un virus en una "fuente definida" o "en células de cultivo" que pueda "propagarse". Por tanto, el término "aislamiento de virus" no es separación (purificación), y subsiste como una definición circular.
1. Levy JA, Fraenkel-Conrat H, Owens RA. Virology. 3rd ed. London: Prentice-Hall; 1994.
2. White DO, Fenner FJ. Medical Virology. 4th ed. San Diego: Academic Press; 1994.
3. Fields BN, Knipe DM, Howley PM, editors. Fundamentals of Virology. Philadelphia: Lippincott-Raven; 1996.
4. Dimmock NJ, Primose SB. Introduction of Modern Virology. 4th ed. Oxford: Blackwell Science; 1996.
5. Timbury MC. Notes on Medical Virology. Edinburgh: Churchill Livingstone; 1994.
6. Papadopulos E, Turner V, Weiss R. Email debate with Professor Robin Weiss on the existence of HIV. 1999.
7. Tahi D. Did Luc Montagnier discover HIV? Text of video interview with Professor Luc Montagnier at the Pasteur Institute July 18th 1997. Continuum 1998;5:30-34.
3. Genelabs Diagnostics "HIV Blot 2.2 Western blot assay and the Abbott Laboratories Diagnostics Division ELISA
4. Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, Shearer GM, Kaplan M, Haynes BF, et al. Frequent Detection and Isolation of Cytopathic Retroviruses (HTLV-III) from Patients with AIDS and at Risk for AIDS. Science 1984;224:500-503.
5. Gallo RC, Sarin PS, Wu AM. On the nature of the Nucleic Acids and RNA Dependent DNA Polymerase from RNA Tumor Viruses and Human Cells. In: Silvestri LG, editor. Possible Episomes in Eukaryotes. Amsterdam: North-Holland Publishing Company; 1973. p. 13-34.
6. El significado de "relacionado" en "antígenos relacionados con el virus" no está claro. ¿Quiso decir Gallo que las proteínas se fabrican bajo la dirección de ADN viral, pero no son constituyentes del virus? ¿O la presencia del virus estimula al ADN celular para fabricar proteínas celulares? ¿Cuál es el destino de estas proteínas? Si son celulares, ¿se "insertan" en el virus? Si son "virales" y no se insertan en el virus, ¿se "pierden" cuando la partícula de virus sale de la célula?
7. El único modo de verificar la especificidad de los tests de anticuerpos es comparar el test con el VIH en sí mismo, es decir, utilizar el VIH como estándar oro. Si los expertos del VIH fueran a hacer esto alguna vez (que hasta ahora no lo han hecho), tal "verificación" equivaldría a probar los tests de anticuerpos contra un test de anticuerpos. Eso sería como afirmar que una fotografía demuestra la identidad de una determinada persona porque es idéntica a otra fotografía de la misma persona.
8. Por desgracia, la advertencia histórica contra el "aislamiento probado mediante anticuerpos", proporcionado por el HL23V, el "primer" retrovirus humano mundial, ha permanecido desconocida, ignorada u olvidada. El HL23V fue "descubierto" por Gallo en 1975 (1), y fue considerado como una "posibilidad real" de ser una causa infecciosa de la leucemia humana (2). De hecho, los datos de "aislamiento" del HL23V sobrepasaban a los del VIH en al menos dos aspectos: a diferencia del VIH, el grupo de Gallo reportó la detección de actividad de transcriptasa inversa en células frescas no cultivadas (3), y también publicaron una micrografía electrónica de partículas con aspecto viral concentrándose en una densidad de sacarosa de 1,16 g/ml (1). Al igual que con el VIH, la existencia del HL23V también se basó en la reactividad de anticuerpos, y en base a que 55/72 (76%) humanos sanos fueron encontrados seropositivos, los autores concluyeron que la infección por HL23V "podría estar extendida en los humanos" (4). Sin embargo, en 1980 investigadores del National Cancer Institute y el Sloan Kettering Cancer Center publicaron datos que probaban que los anticuerpos del "HL23V" eran no específicos, sobre la base de que la preadsorción de sueros con "sustancias tan diversas como componentes normales de suero, extractos de bacteria, e incluso moléculas no proteicas como el glucógeno" eliminaban la reactividad, y que "Los resultados son consistentes con la idea de que los anticuerpos en cuestión aparecen como resultado de la exposición a muchas sustancias naturales que poseen antígenos de amplia reacción cruzada, y no son el resultado de una infección generalizada de las personas con oncovirus competentes de replicación [retrovirus]" (5, 6). En 1981 Gallo aceptó las pruebas de que los anticuerpos que reaccionaban con las proteínas del HL23V, no estaban dirigidos contra las proteínas "sino contra las partes de carbohidrato [moléculas] en la molécula que se introducen mediante la célula huésped como un evento post-transcriptional [tras la producción a partir de ADN y ARN], y que por tanto son específicos de la célula y no específicos del virus" (7). Este descubrimiento fue de tal importancia que en la actualidad nadie, ni siquiera Gallo, considera al HL23V como el primer retrovirus humano, ni siquiera como un retrovirus. Sin embargo, a pesar de los hechos de que las proteínas de "envoltura" del VIH también son glicoproteínas y micobacterias (8), y que los antígenos fúngicos (9) también adsorben los anticuerpos del "VIH", al VIH se le sigue considerando como un virus. Al menos un experto ha intentado deshacerse del HL23V como un "callejón sin salida". Sin embargo, si el HL23V es un callejón sin salida, entonces el VIH lo es aún más. Un tratamiento de este asunto extremadamente interesante, por el periodista de investigación John Crewdson, se puede encontrar aquí.
1. Gallagher RE, Gallo RC. Type C RNA Tumor Virus Isolated from Cultured Human Acute Myelogenous Leukemia Cells. Science 1975;187:350-353.
2. Kurth R, Teich NM, Weiss R, Oliver RTD. Natural human antibodies reactive with primate type-C antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1977;74:1237-1241.
3. Gallo RC, Wong-Staal F, Reitz M, Gallagher RE, Miller N, Gillespie DH. Some evidence for infectious type-C virus in humans. In: Balimore D, Huang AS, Fox CF, editors. Animal Virology. New York: Academic Press Inc.; 1976. p. 385-405.
4. Aoki T, Walling MJ, Bushar GS, Liu M, Hsu KC. Natural antibodies in sera from healthy humans to antigens on surfaces of type C RNA viruses and cells from primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A 1976;73(7):2491-5.
5. Barbacid M, Bolognesi D, Aaronson SA. Humans have antibodies capable of recognizing oncoviral glycoproteins: Demonstration that these antibodies are formed in response to cellular modification of glycoproteins rather than as consequence of exposure to virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1980;77:1617-1621.
6. Snyder HW, Fleissner E. Specificity of human antibodies to oncovirus glycoproteins: Recognition of antigen by natural antibodies directed against carbohydrate structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1980;77:1622-1626.
7. Kalyanaraman VS, Sarngadharan MG, Bunn PA, Minna JD, Gallo RC. Antibodies in human sera reactive against an internal structural protein of human T-cell lymphoma virus. Nature 1981;294:271-273.
8. Kashala O, Marlink R, Ilunga M, Diese M, Gormus B, Xu K, et al. Infection with human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and human T cell lymphotropic viruses among leprosy patients and contacts: correlation between HIV-1 cross-reactivity and antibodies to lipoarabinomannan. Journal of Infectious Diseases 1994;169:296-304.
9. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou JM, Causer D. HIV antibodies: Further questions and a plea for clarification. Current Medical Research and Opinion 1997;13:627-634.
9. ¿Es un Western blot positivo prueba de infección con el VIH?
10. ¿Ha probado Gallo el papel del VIH en el SIDA?
11. Entrevista a Eleni Papadopulos-Eleopulos
12. A great future behind it: The Yin and Yang of HIV
13. The Last Debate
