El Grupo de Perth sostiene que nadie ha demostrado la existencia del virus VIH, y que el sida se debe a la oxidación.

miércoles, 16 de septiembre de 2015

Entrevista a Luc Montagnier



theperthgroup.com/CONTINUUM/djamelmontagnier.html


Otra traducción disponible AQUÍ.


¿Descrubrió Luc Montagnier el virus VIH?
Por Djamel Tahi
Continuum Invierno 1997


DT: Un grupo de científicos de Australia sostiene que nadie hasta ahora ha aislado el virus del sida, el VIH. Para ellos las reglas de aislamiento de retrovirus no se han respetado cuidadosamente para el VIH. Estas reglas son: cultivo, purificación del material mediante ultracentrifugación, fotografías de microscopía electrónica (ME) del material que se concentra a la densidad de los retrovirus, caracterización de estas partículas, prueba de la infectividad de las partículas.

LM: No, eso no es aislamiento. Nosotros conseguimos el aislamiento porque "pasamos" el virus, hicimos un cultivo del virus. Por ejemplo, Gallo dijo: "Ellos no aislaron el virus ... y nosotros (Gallo et al) lo hemos hecho emerger en abundancia en una línea de células inmortal". Pero antes de hacerlo emerger en líneas de células inmortales, nosotros lo hicimos emerger en cultivos de linfocitos normales de un donante de sangre. Ese es el criterio principal. Se tuvo algo que se podía pasar en serie, que se podía mantener. Y caracterizado como un retrovirus no solamente por sus propiedades visuales, sino también bioquímicamente: la actividad de RT [transcriptasa inversa] que es verdaderamente específica de los retrovirus. También tuvimos las reacciones de anticuerpos contra algunas proteínas, probablemente las proteínas internas. Digo probablemente por analogía con el conocimiento de otros retrovirus. No se podía haber aislado este retrovirus sin el conocimiento de otros retrovirus, eso es obvio. Pero creo que hemos respondido a los criterios de aislamiento, totalmente.


DT: Déjeme volver a las reglas de aislamiento de retrovirus, que son: cultivo, purificación a la densidad de los retrovirus, fotografías de ME del material a la densidad de los retrovirus, caracterización de las partículas, prueba de la infectividad de las partículas. ¿Se han hecho todos estos pasos para el aislamiento del VIH? Me gustaría añadir que, según varias referencias publicadas citadas por el grupo de Australia, la RT no es específica a los retrovirus y, además, el trabajo de ustedes para detectar RT no se hizo en el material purificado.

LM: Creo que publicamos en Science (Mayo 1983) un gradiente que mostraba que la RT tenía exactamente la densidad de 1,16 g/ml. Así que se tenía un pico que era RT. Por tanto, se ha cumplido este criterio de purificación. Pero pasarlo en serie es difícil porque, cuando se pone el material a purificar, en un gradiente, los retrovirus son muy frágiles, por lo que se rompen entre sí y pierden en gran medida su infectividad. Pero pienso que aún así fuimos capaces de mantener un poco de su infectividad. Pero no fue tan fácil a como se hace hoy en día, porque las cantidades de virus eran, no obstante, muy débiles. Al principio nos encontramos con un virus que no mataba a las células. El virus procedía de un paciente asintomático, y se clasificó entre los virus no formadores de sicintios, no citopatógenos utilizando el coreceptor ccr5. Fue el primer virus de BRU. Se tenía muy poco de él, y no se podía pasar en una línea de células inmortal. Lo intentamos durante algunos meses, no tuvimos éxito. Tuvimos éxito muy fácilmente con la segunda cepa. Pero ahí está el muy misterioso problema de la contanimación de esa segunda cepa por la primera. Eso fue LAI.


DT: ¿Por qué las fotografías de ME publicadas por ustedes provienen del cultivo y no de la purificación?

LM: Había tan poca producción de virus que era imposible ver lo que podría haber en un concentrado de virus mediante un gradiente. No había suficiente virus para hacer eso. Por supuesto se intentó, se buscó en los tejidos del comienzo, así como en la biopsia. Vimos algunas partículas, pero no tenían la morfología típica de los retrovirus. Eran muy distintas, relativamente distintas. Con el cultivo llevó muchas horas encontrar las primeras imágenes. ¡Fue un esfuerzo romano! Es fácil criticarlo después de hecho. Lo que no tuvimos, y siempre lo he reconocido, fue que realmente fuera la causa del sida.


DT: ¿Cómo es posible, sin fotografías de ME de la purificación, saber si estas partículas son virales y tienen que ver con un retrovirus, menos aún un retrovirus específico?

LM: Bueno, estaban las fotos de la gemación. Publicamos imágenes de gemación que son características de los retrovirus. Dicho esto, decir que de solamente la morfología no se podía afirmar que era realmente un retrovirus. Por ejemplo, un especialista frances de ME's de retrovirus me atacó publicamente diciendo: "Esto no es un retrovirus, es un arenavirus", porque hay otras familias de virus que geman y tienen puntas en la superficie, etc.


DT: ¿Por qué esta confusión? ¿Las fotografías de ME no mostraron claramente un retrovirus?

LM: En este periodo los retrovirus más conocidos eran los de tipo C, que eran muy típicos. Este retrovirus no era un tipo C, y los lentivirus eran poco conocidos. Yo mismo lo reconocí mirando fotografías del virus de anemia infecciosa equina en la biblioteca, y mas tarde del virus Visna. Pero repito, no fue solamente la morfología y las gemaciones, hubo RT ... fue el conjunto de estas propiedades lo que me hizo decir que era un retrovirus.


DT: Acerca de la RT, se detecta en el cultivo. Luego está la purificación, donde se encuentran las partículas retrovirales. Pero a esta densidad hay muchos otros elementos, entre estos los que se llaman "con aspecto viral".

LM: Exactamente, exactamente. Si lo prefieres, no fue una propiedad sino el conjunto de las propiedades el que nos hizo decir que era un retrovirus de la familia de los lentivirus. Tomadas de forma aislada, cada una de las propiedades no es verdaderamente específica, pero sí el conjunto de todas ellas. Así que tuvimos: la densidad, la RT, las fotos de las gemaciones, y la analogía con el virus visna. Esas son las cuatro características.


DT: Pero ¿cómo todos estos elementos prueban que es un nuevo retrovirus? ¿algunos de estos elementos podían tener que ver con otras cosas, con "aspecto viral"?

LM: Sí, y es más, tenemos retrovirus endógenos que a veces expresan partículas, pero de origen endógeno, y que por tanto no tienen un papel patológico, en ningún caso en el sida.


DT: Pero entonces, ¿cómo puede saberse la diferencia?

LT: Porque nosotros pudimos "pasar" el virus. Pasamos la actividad de RT en nuevos linfocitos, obtuvimos un pico de replicación, seguimos la pista del virus. Es el conjunto de propiedades lo que nos hizo decir que era un retrovirus. Y ¿por qué nuevo?. La primera pregunta que nos hizo Nature fue "¿No es una contaminación de laboratorio? ¿Es quizá un retrovirus de ratón o un retrovirus animal?". A eso se podía decir que no, porque habíamos demostrado que el paciente tenía anticuerpos contra una proteína de su propio virus. ¡El conjunto tiene una lógica perfecta! Pero es importante tomar el conjunto entero. Si se toma cada propiedad separadamente, ninguna es específica, es el conjunto el que da la especificidad.


DT: Pero en la densidad de los retrovirus, ¿observó partículas que parecían ser retrovirus, un nuevo retrovirus?

LT: En la densidad de 1,15 ; 1,16 tuvimos un pico de actividad de RT, que es la enzima característica de los retrovirus.


DT: Pero ¿podría ser otra cosa?

LT: No, en mi opinión era muy claro. No podía ser otra cosa que un retrovirus de ese modo. Porque la enzima que F. Barre-Sinoussi caracterizó bioquímicamente necesitaba magnesio, un poco como el HTLV en otro sitio. Requirió la matriz, la plantilla, y también el cebador, lo que era completamente característico de una RT. No hubo discusión en eso. En Cold Spring Harbour, en septiembre de 1983, Gallo me preguntó si estaba seguro de que era una RT. Yo lo sabía, F. Barre-Sinoussi hizo todos los controles para eso. No era meramente una polimerasa celular, era una RT. Funcionó solamente con plantillas de ARN, e hizo ADN. Eso era seguro.


DT: Con los demás retrovirus que ha conocido en su carrera, ¿siguió el mismo proceso y tuvo las mismas dificultades?

LT: Yo diría que para el VIH fue un proceso fácil. En comparación con los obstáculos que se encuentran para los demás ... porque el virus no emergé, o incluso porque el aislamiento es esporádico, te las arreglas una vez de cada cinco. Estoy hablando de la investigación actual de otras enfermedades. Se puede citar el virus de la esclerosis múltiple del Profesor Perón. Me mostró su trabajo hace una década, y le llevó alrededor de diez años encontrar finalmente una secuencia génica, que está muy cerca de un virus endógeno. Ya ves, es muy difícil, porque no podía "pasar" el virus, no podía hacerlo emerger en el cultivo. Mientras tanto, el VIH emerge muy fácilmente. La cepa LAI, por ejemplo. Eso es por lo que contaminó a las otras.


DT: ¿Con qué cultivó los linfocitos de su paciente? ¿Con la línea de células H9?

LM: No, porque con la H9 no funcionaba en absoluto. Utilizamos muchas líneas de células, y la única que podía producir eran los linfocitos Tambon.


DT: Pero utilizando estos tipos de elementos es posible introducir otras cosas capaces de inducir una RT y proteínas, etc.

LM: Totalmente de acuerdo. Eso es por lo que, finalmente, no fuimos muy partidarios de utilizar líneas de células inmortales. Para cultivar el virus en masa sí, pero no para caracterizarlo, porque sabíamos que ibamos a traer otras cosas. Hay líneas de células MT, encontradas por los japoneses (MT2, MT4), que replican el VIH muy bien y que, al mismo tiempo, se transforman mediante el HTLV. Por lo tanto, se tiene una mezcla del VIH y el HTLV, una verdadera sopa.


DT: Más aún, ¿no es posible que los pacientes puedan estar infectados por otros agentes infecciosos?

LM: Podía haber micoplasmas ... podía haber un montón de cosas. Pero afortunadamente tuvimos la experiencia negativa de los virus asociados con cancer, y eso nos ayudó, porque nos habíamos encontrado con todos estos problemas. Por ejemplo, un día tuve un pico muy bueno de RT, que me dio F. Barre-Sinoussi, con una densidad un poco más alta, de 1,19. ¡La comprobé! , era un micoplasma, no un retrovirus.


DT: Con el material purificado en la densidad de los retrovirus, ¿cómo es posible diferenciar entre lo que es viral y no lo es? Puesto que a esta densidad hay muchas otras cosas, incluyendo partículas "con aspecto viral", fragmentos celulares ...

LM: Sí, por eso es más fácil con el cultivo de células, porque se ven las fases de la producción de virus. Se tienen las gemaciones. Charles Dauget (un especialista de ME) vio detalladamente las células. Por supuesto miró el plasma, el concentrado, etc ... no vió nada importante. Porque si se hace un concentrado es necesario hacer una sección fina [para ver un virus con la ME], y para hacer una sección fina es necesario tener un concentrado de al menos el tamaño de la cabeza de un alfiler. De este modo, son necesarias enormes cantidades de virus. Por el contrario, se hace una sección delgada de células muy fácilmente, y en estas secciones delgadas Charles Dauget encontró el retrovirus, con diferentes fases en las gemaciones.


DT: Cuando se miran las fotografías de microscopio electrónico publicadas, para usted, como retrovirólogo, ¿está claro que es un retrovirus, un nuevo retrovirus?

LM: No, en ese momento no se puede decir, Con las primeras imágenes de gemaciones podría ser un virus tipo C. No se puede distinguir.


DT: ¿Podría ser algo distinto a un retrovirus?

LM: No ... bueno, al final sí, podría ser otro virus en gemación. Pero tenemos un atlas. Se sabe un poco lo que es un retrovirus y lo que no lo es, por familiaridad. Con la morfología es posible distinguirlo, pero conlleva cierta familiaridad.


DT: ¿Por qué no hubo purificación?

LM: Repito que no purificamos. Purificamos para caracterizar la densidad de la RT, que era ciertamente la de un retrovirus. Pero no tomamos el pico ... o no funcionó ... porque si se purifica se daña. Así que para partículas infecciosas es mejor no tocarlas demasiado, por lo que simplemente se toma el sobrenadante del cultivo de linfocitos que han producido el virus y se pone en una pequeña cantidad en algunos cultivos nuevos de linfocitos. Y ocurre, se pasa el retrovirus en serie y se obtienen siempre las mismas características, y se aumenta la producción cada vez que se pasa.


DT: Entonces ¿la etapa de purificación no es necesaria?

LM: No, no es necesaria. Lo que es esencial es pasar el virus. El problema que tuvo Peron con el virus de la esclerosis múltiple fue que no pudo pasar el virus de un cultivo a otro. Ese es el problema. Lo logró muy poco, no lo suficiente para caracterizarlo. Y en estos días caracterizar significa por encima de todo a nivel molecular. Si se hace, el procedimiento va más rápidamente. Para hacerlo: un ADN, clonar este ADN, amplificarlo, secuenciarlo, etc. Así se tiene el ADN, la secuencia de ADN que te dice si es verdaderamente un retrovirus. Se sabe la estructura familiar de los retrovirus, todos los retrovirus tienen una estructura genómica familiar con tal y tal gen, que es característica.


DT: Entonces, ¿para el aislamiento de retrovirus no es obligatoria la etapa de purificación?, ¿se pueden aislar retrovirus sin purificarlos?

LM: Sí, no es obligatorio transmitir material puro. Sería mejor, pero está el problema de que se daña, y se disminuye la infectividad de los retrovirus.


DT: Sin pasar por esta etapa de purificación, ¿no existe riesgo de confusión acerca de las proteínas que se identifican, y también acerca de la RT, que podría provenir de otra cosa?

LM: No, después de todo, repito, si teníamos un pico de RT a la densidad de 1,15; 1,16, hay 999 posibilidades de 1000 de que fuese un retrovirus. Pero podría ser un retrovirus de origen distinto. Repito, hay algunos retrovirus endógenos, pseudo-partículas que pueden ser emitidas por las células, pero aún así, desde la parte del genoma que proporciona retrovirus. Y que se adquiere a través de la herencia, en las células por un tiempo muy largo. Pero finalmente, pensando en la prueba - porque las cosas evolucionan, como la biología molecular, permitiendo incluso una más fácil caracterización hoy en día - es necesario seguir adelante muy rápidamente con la clonación. Y eso se hizo muy rápidamente, tanto por Gallo como por nosotros mismos. La clonación y secuenciación, y así se tenía una caracterización completa. Pero repito, la primera caracterización fue la pertenencia a la familia de lentivirus, la densidad, las gemaciones, etc ... las propiedades biológicas, la asociación con las células T4. Todas estas cosas son parte de la caracterización, y fuimos nosotros quienes las hicimos.


DT: Pero llega un momento en que se debe hacer la caracterización del virus, es decir, ¿de qué proteínas está compuesto?

LM: Así es, porque el análisis de las proteínas del virus exige la producción en masa y la purificación, es necesario hacer eso. Y ahí debería decir que eso falló parcialmente. J.C. Chermann estaba a cargo de eso, al menos para las proteínas internas, y tuvo dificultades para producir el virus y no funcionó. Pero esto era una forma posible, la otra forma era tener el ácido nucléico, la clonación, etc. En esta manera funcionó muy rápidamente. El otro modo no funcionó porque tuvimos en ese momento un sistema de producción que no era lo suficientemente robusto. No se produjeron suficientes partículas para purificar y caracterizar las proteínas virales, no se pudo hacer. No se pudo producir una gran cantidad de virus en ese momento porque este virus no emergió en la línea celular inmortal. Lo pudimos haber hecho con el virus LAI, pero en ese momento no sabíamos eso.


DT: ¿Gallo lo hizo?

LM: ¿Gallo? ... No sé si realmente purificó, no lo creo. Creo que él se puso de lleno muy rápidamente con la parte molecular, es decir la clonación. Lo que él hizo es el Western blot. Nosotros utilizamos la técnica RIPA, y lo que lo que ellos hicieron que era nuevo fue que mostraron algunas proteínas que no se habían visto bien con la otra técnica. Aquí se tiene otro aspecto de caracterizar el virus. No se puede purificar, pero si se sabe que alguien tiene anticuerpos contra las proteínas del virus, se puede purificar el complejo anticuerpo-antígeno. Eso es lo que se hizo. Y así se tenía una banda visible, marcada radioactivamente, que se llamó proteína 25, p25. Y Gallo vio otras. Se tuvo la p25, que él llamó p24, se tuvo la p41, que nosotros vimos ...


DT: Sobre los anticuerpos, numerosos estudios han demostrado que estos anticuerpos reaccionan con otras proteínas o elementos que no forman parte del VIH. Y que no pueden ser suficientes para caracterizar las proteínas del VIH.

LM: ¡No!, porque teníamos controles. Teníamos personas que no tenían sida y no tenían anticuerpos contra estas proteínas. Y las técnicas que utilizamos las había refinado yo mismo algunos años antes, para detectar el gen src. Se puede ver que el gen src se detectaba por inmunoprecipitación también. Fue la p60 [proteína p60]. Yo fui muy hábil, y mi técnico también, con la ténica RIPA. Si se tiene una reacción específica, es específica.


DT: Pero se sabe que los pacientes de sida están infectados con multitud de otros agentes infecciosos que son susceptibles a ...

LM: Ah, sí, pero los anticuerpos son muy específicos. Saben como distinguir una molécula de un millón, hay una afinidad muy grande. Cuando los anticuerpos tienen suficiente afinidad, se obtiene algo realmente muy específico. Con los anticuerpos monoclonales se obtiene realmente una proteína. Todo eso se utiliza para la detección de antígenos de diagnóstico.


DT: Para usted la p41 no tenía origen viral, por lo que no pertenecía al VIH. Para Gallo era la proteína más específica del VIH. ¿Por qué esta contradicción?

LM: Los dos teníamos bastante razón. Quiero decir que yo, en mi técnica RIPA ... en efecto hay proteínas celulares que se encuentran en todas partes. Hay un "ruido de fondo" no específico, y entre estas proteínas hay una muy abundante en las células, que es la actina. Y esta proteína tiene un peso molecular de 43.000 kd. Así que allí estaba, y yo tenía bastante razón, pero lo que Gallo vio por otra parte fue la gp41 del VIH, porque él estaba utilizando el Western Blot. Y yo lo he reconocido.


DT: Para usted la p24 fue la proteína más específica del VIH, para Gallo en absoluto. Se sabe, gracias a otros estudios, que los anticuerpos dirigidos contra la p24 se encontraron a menudo en pacientes que no estaban infectados con el VIH, e incluso en ciertos animales. De hecho, hoy en día, una reacción de anticuerpo con la p24 se considera no específica.

LM: No es suficiente para el diagnóstico de la infección por VIH.


DT: ¿No es suficiente una proteína?

LM: No es suficiente una proteína de ninguna manera. Pero en ese momento el problema no se mostró así. El problema era saber si era un HTLV o no. El único retrovirus humano conocido era el HTLV, y nosotros demostramos claramente que no era un HTLV, que los anticuerpos monoclonales de Gallo contra la p24 del HTLV no reconocían la p25 del VIH.


DT: En la densidad de los retrovirus, 1,16 g/ml, hay muchas partículas, pero solamente el 20% tienen que ver con el VIH. ¿Por qué el 80% de las proteínas no son virales y las otras sí lo son? ¿Cómo se pueden distinguir?

LM: Hay dos explicaciones. Por una parte, a esta densidad se tiene lo que se llaman microvesículas de origen celular, que tienen aproximadamente el mismo tamaño que el virus. Y también el propio virus, en gemación, aporta proteínas celulares. Así que efectivamente estas proteínas no son virales, son de origen celular. Entonces, ¿como distinguirlas de las virales?. Francamente con esta técnica no se puede hacer con precisión. Lo que podemos hacer es purificar el virus al máximo con gradientes sucesivos, y siempre se tropieza con las mismas proteínas.


DT: ¿Las otras desaparecen?

LM: Digamos que las otras se reducen un poco. Se van las microvesículas, pero cada vez se pierde mucho virus, por lo que es necesario tener mucho virus al comienzo con el fin de que se mantenga un poco al llegar al final. Y de nuevo, es el análisis molecular, es la secuencia de estas proteínas lo que va a permitir decir si son o no son de origen viral. Eso es lo que comenzamos para la p25, que falló ... y la otra técnica es hacer la clonación, y así entonces se tiene el ADN, y del ADN se obtienen las proteínas. Se deducen la secuencia de las proteínas y su tamaño, y se tropieza de nuevo en lo que ha se ha observado con inmunoprecipitación o con electroforesis en gel. Y se sabe por analogía con los tamaños de las proteínas de otros retrovirus, se pueden deducir bastante bien estas proteínas. Por tanto se tiene la p25, que estaba cerca de la p24 del HTLV, se tiene la p18 ... al final tienes las otras. Por otra parte, la que fue muy diferente fue la proteína muy grande p120.


DT: En la actualidad, ¿los problemas acerca de la producción masiva del virus, la purificación, las fotos de ME a 1,16, están resueltos?

LM: Sí, por supuesto.


DT: ¿Existen fotos de ME del VIH de la purificación?

LM: Sí, por supuesto.


DT: ¿Han sido publicadas?

LM: No podría decirte ... tenemos algunas en alguna parte ... pero no tienen interés, ningún interés.


DT: Hoy en día, con la producción en masa del virus, ¿es posible ver una ME, tras la purificación, de un gran número de virus?

LM: Sí, sí, claro que sí. Pueden verse, incluso se ven bandas visibles.


DT: Entonces, ¿para usted el VIH existe?

LM: Oh, está claro, yo lo ví y lo encontré.



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