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UN ANÁLISIS CRÍTICO DEL ARTÍCULO INICIAL DE MONTAGNIER DE 1983
“Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS)”. Science 1983; 220:868-71
Eleni Papadopulos-Eleopulos, Nuclear Physicist and Biophysicist, Perth, Western Australia
Valendar F. Turner, Emergency Physician, Perth, Western Australia
John M Papadimitriou, Emeritus Professor of Pathology, Crawley, Western Australia
Barry A. P. Page Physicist, Perth, Western Australia
David Causer Physicist, Perth, Western Australia
October 28th 2008
El primer experimento: datos de Montagnier y su interpretación
Datos
Las células obtenidas a partir de los ganglios linfáticos agrandados de un hombre homosexual (BRU) se cultivaron con PHA, IL-2 y antisuero a interferón alfa humano. En el sobrenadante del cultivo se encontró transcripción inversa del cebador-plantilla sintético An.dT12-18 (actividad de transcriptasa inversa [RT]), utilizando Mg2+ como catión divalente.
Interpretación
Prueba del aislamiento y la producción de un retrovirus.
El segundo experimento: datos de Montagnier y su interpretación
Datos
Se cultivaron linfocitos T de un donante de sangre durante tres días. Entonces la mitad de este cultivo fue cocultivado con linfocitos de los ganglios linfáticos de BRU. Se detectó actividad de transcriptasa inversa (RT) en el cocultivo, pero no en los cultivos que contenían linfocitos T del donante de sangre sano.
Interpretación
Transmisión del virus desde las células de BRU a las células del donante de sangre.
COMENTARIOS
1. Ningún experimento tuvo controles. Un control es una "parte esencial de un experimiento científico válido, diseñado para mostrar que el factor que se somete a test es realmente responsable del efecto observado. Todos los factores en el experimento de control, excepto el que se somete a test, son exactamente iguales que en los experimentos de test, y se llevan a cabo las mismas medidas"
( http://www.tiscali.co.uk/reference/encyclopaedia/hutchinson/m0024903.html ).
El primer experimento de Montagnier debería haber incluido un cultivo que hubiese sometido a test células obtenidas de pacientes con anomalías clínicas y bioquímicas similares a BRU pero sin riesgo de sida. En el segundo experimento el control debería haber consistido en células de individuos enfermos similares cocultivadas con células de donante de sangre sano.
2. Para evitar el sesgo, ambos experimentos (test y control) deben realizarse a ciegas.
3. La principal característica de los virus es que son partículas microscópicas con unas determinadas morfologías. No se reportó ninguna prueba de la existencia de partículas de ninguno de los dos experimentos de Montagnier.
4. Puesto que el cocultivo contenía no solamente linfocitos del donante de sangre sano, sino también linfocitos de los ganglios linfáticos de BRU, la detección de actividad de RT no puede considerarse como prueba de transmisión viral. La actividad podría haberse debido únicamente a las células de BRU.
5. Según el diccionario, "aislamiento" proviene del Latin "insulatis", que significa "hecho a una isla". Aislamiento significa poner aparte o ello solo, o separar una sustancia de una mezcla de todo lo demás en esa mezcla. Por tanto, aislamiento = purificación. La detección de transcripción inversa no es aislamiento de una partícula viral ni de nada. Por ejemplo, cuando un doctor pide una prueba sanguínea en un paciente con dolor de pecho, esta buscando datos acerca de enzimas que se filtren desde las células del músculo del corazón herido al flujo sanguíneo. Si tales enzimas están presentes, nadie llamaría a esto "aislamiento del corazón". La detección de actividad de RT podía considerarse como prueba de la detección de un retrovirus si y solamente si es específica de los retrovirus. No es el caso.
6. Las enzimas que causan transcripción inversa fueron descubiertas en primer lugar en partículas retrovirales en 1970, independientemente por Temin/Mituzani y por Baltimore. Algunos expertos del supuesto virus VIH creen que esta actividad enzimática es específica a los retrovirus e incluso "absolutamente singular del grupo de lentivirus" (1), es decir, única del grupo de retrovirus que Montagnier ahora afirma que pertenece el "VIH". No es el caso.
7. Temin fue uno de los primeros en afirmar y probar que la transcripción inversa no es específica de los retrovirus (2-4). En 1972, en un encuentro que tuvo lugar en el Instituto Pasteur con Jean Claude Chermann como secretario, Barre-Sinoussi y Chermann, el primer y segundo autor del artículo de Montagnier de 1983, fueron plenamente conscientes de que la transcripción inversa no es específica de los retrovirus. "Esta actividad enzimática puede explicarse por la presencia de algunas partículas de virus en estas zonas [bandas de densidad de sacarosa distintas de la de 1,16 g/ml], y puesto que se ha encontrado actividad de polimerasa similar en células normales, podría ser atribuida principalmente a la enzima celular" (5).
8. En 1973 Gallo informó haber encontrado, en células leucémicas, una proteína con propiedades de transcriptasa inversa "estrechamente relacionada con la enzima de retrovirus de primates ... pero debe enfatizarse que este resultado no indica que la enzima se encuentre específicamente solo en células leucémicas ... será importante determinar si esta actividad se encuentra solamente en células neoplásicas o si se presenta de modo general en células que proliferan rapidamente" (6). En el mismo año Gallo confirmó que "Muchos laboratorios posteriormente reportaron la detección de transcriptasa inversa en fragmentos de células normales" (7). Los propios Gallo y sus colegas informaron: "Se obtuvo una actividad de ADN polimerasa ... endógena y totalmente dependiente de ARN [transcriptasa inversa] a partir de linfocitos de sangre leucémica (y mieloblastos) y a partir de linfocitos de sangre humana normal estimulados con PHA (pero no en no estimulados)". Tanto la An.dT15 como la Cn.dT15 son copiadas por material que se concentra a 1,16 g/ml, originado de linfocitos normales no infectados pero mitogénicamente estimulados (7-9). En 1976 Gallo enfatizó que para probar que una enzima que transcribe inversamente es retroviral uno tiene que:
(a) primero purificar las partículas retrovirales
"A. PURIFICACIÓN DE UN VIRUS. Para la detección y el análisis de reacciones enzimáticas asociadas a virus, es esencial utilizar preparaciones de virus libres de contaminantes celulares lo más posible", mediante la concentración en banda con "gradientes de densidad de sacarosa";
(b)"1. La enzima debería estar presente en una fracción determinada, y catalizar una síntesis endógena de ADN ...
2. Es esencial demostrar que, en la síntesis endógena de ADN, el producto de ADN debería al menos ser en parte un híbrido ARN.ADN ... que el producto de ADN debería hibridizar hacia atrás a ARN en la partícula. Todo esto demostrará que la síntesis endógena es dirigida a ARN.
3. La enzima purificada debería mostrar preferencia por (dT)~15.(A)n sobre (dT)~15.(dA)n como cebador-plantilla (con Mg2+ o Mn2+)" (7).
En el mismo artículo Gallo también escribió: "Las transcriptasas inversas de distintos virus tipo C de mamíferos son en general de tamaño 4,5 S, muestran mucha más actividad en la presencia de Mn2+ que con Mg2+ (cuando se utilizan cebadores-plantillas sintéticos), y están relacionadas por propiedades inmunológicas, aunque en general se pueden distinguir una de otra mediante los mismos ensayos" [sic] (7).
9. En 1975 llegó a ser claro que la transcripción inversa puede catalizarse no solamente por trasncriptasas inversas, sino también por ADN polimerasas celulares. De hecho, en 1975 una conferencia internacional sobre ADN polimerasas eucarióticas definió la ADN polimerasa gamma como la enzima celular que "copia An.dT15 con alta eficiencia, pero no copia ADN bien" (10). De este modo, la copia del cebador-plantilla An.dT15 no puede considerarse como sinónimo de la presencia de una transcriptasa inversa, retroviral o celular, y ciertamente no puede considerarse prueba de detección, producción y aislamiento retroviral.
10. En 1984, Rey y Montagnier publicaron un artículo titulado "Characterization of the RNA dependent DNA polymerase of a new human T-lymphotropic retrovirus (lymphadenopathy associated virus)”. Este artículo ha sido analizado en detalle en algunos posts del debate online del BMJ (11) (buscar por "Montagnier’s reverse transcriptase activity"). Aquí es suficiente decir que en el artículo de Rey no se puede encontrar ninguna prueba de la existencia de una transcriptasa inversa retroviral, basándose en los datos enumerados (anteriormente) por Gallo. Por ejemplo, Montagnier afirma que, puesto que su enzima prefiere Mg2+ a Mn2+, era una enzima de un retrovirus de mamífero. Sin embargo según Gallo (escrito antes), "Las transcriptasas inversas de distintos virus tipo C de mamíferos ... muestran mucha más actividad en la presencia de Mn2+ que con Mg2+ (cuando se utilizan cebadores-plantillas sintéticos)". Por otra parte, se sabe desde hace más de 40 años que las ADN polimerasas celulares utilizan Mg2+ como catión bivalente. De hecho Montagnier no cumple sus propias reglas. En julio de 1997 Montagnier fue entrevistado delante de una cámara en el Instituto Pasteur por el periodista frances Djamel Tahi. A Montagnier se le preguntó: "Pero llega un momento en que se debe hacer la caracterización del virus, es decir, ¿de qué proteínas está compuesto?" El contestó "... el análisis de las proteínas del virus exige la producción en masa y la purificación, es necesario hacerlo" (12). Sin embargo, en el artículo de Rey, Montagnier afirma que "esta enzima puede distinguirse de otras actividades de ADN polimerasas celulares y de la desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) mediante la purificación a partir de linfocitos T infectados con LAV utilizando columna de fosfocelulosa. En otras palabras, aunque Montagnier está de acuerdo en que la caracterización de proteínas virales requiere la purificación de las partículas virales, en 1984 afirmó haber caracterizado la transcriptasa inversa del VIH mediante la purificación de una proteína de cultivos celulares, no de partículas retrovirales. De hecho, en este artículo Montagnier no presentó ninguna prueba de que ni siquiera existiesen partículas retrovirales en sus cultivos de células, menos aún la purificación de partículas. Incluso si se acepta que la proteína que purificó a partir de "linfocitos infectados con LAV" era una transcriptasa inversa, ¿cómo sabía que era una RT del VIH y no una RT celular? (El videocasete de esta entrevista es propiedad de Djamel Tahi [correo dtahi@terraincognita.fr]).
11. Según Varmus, "la transcripción inversa es apenas única de los retrovirus; se reconoce ahora como un fenómeno generalizado de las células eucarióticas" (13). Sin embargo, al responder a la primera pregunta de la entrevista de Tahi, Montagnier dijo que la transcriptasa inversa es "verdaderamente específica de los retrovirus". Pero ocho preguntas más adelante Montagnier admitió que la transcriptasa inversa es solamente una característica de los retrovirus. En una pregunta posterior Montagnier respondió: "repito, si teníamos un pico de RT a la densidad de 1,15; 1,16, hay 999 posibilidades de 1000 de que fuese un retrovirus". Sin embargo, a estas densidades Montagnier solamente tenía restos celulares, y no partículas con la morfología de los retrovirus (ver más adelante). Esto significa que Montagnier tuvo buenas pruebas de que su actividad de RT se debía a una transcriptasa inversa celular o a una ADN polimerasa, no teniendo nada que ver con un retrovirus. La no especificidad de la transcriptasa inversa ha aparecido incluso en la prensa popular. En febrero de 2001 la revista australiana Shares publicó un artículo acerca de la inversión en acciones de biotecnología, que señaló que la transcripción inversa no es específica de los retrovirus. (14).
El tercer experimento: datos de Montagnier y su interpretación
En este experimento se cultivaron linfocitos de cordón umbilical con sobrenadantes libres de células obtenidos del cocultivo de las células de BRU y las del donante de sangre sano. Los datos se pueden dividir en dos: la microscopía electrónica y la purificación.
A. Microscopía electrónica
Se publicó una micrografía electrónica mostrando partículas con aspecto retroviral en gemación y también libres de células. En el texto se puede leer: "La microscopía electrónica de los linfocitos de cordón umbilical infectados mostró partículas inmaduras características con una medialuna densa (tipo C) gemando en la membrana de plasma". En el resumen se puede leer: "Este virus es un virus de tumor de ARN tipo C típico".
Interpretación
El virus aislado de BRU es una partícula de Oncovirus tipo C.
COMENTARIOS
1. La familia Retroviridae se divide en subfamilias conocidas como Oncovirus, Lentivirus y Spumavirus. Los Oncovirus se dividen en tres géneros llamados Oncovirus tipo B, tipo C y tipo D. Los Lentivirus tienen un genero único.
2. Las apariencias morfológicas de las partículas retrovirales no son específicas. Esto fue aceptado en los años 1970 por muchos retrovirólogos ilustres, incluyendo a Temin. En 1976 Robert Gallo escribió "se ha observado frecuentemente en tejidos leucémicos la liberación de partículas de aspecto viral, morfológicamente y bioquímicamente [que transcriben inversamente] parecidas a los virus tipo C, pero aparentemente sin la habilidad de replicarse" (15). Debido a esto, para afirmar que una partícula con aspecto retroviral es un retrovirus se deben realizar algunos pasos, como se enumeraron en el encuentro del Instituto Pasteur de 1972. (5) (16-17). Montagnier nunca ha publicado ninguna prueba de ni siquiera el primer paso, es decir, ME's de dos cultivos consecutivos mostrando partículas con aspecto retroviral con características morfológicas idénticas.
3. Todos los retrovirólogos, incluyendo a Temin, Todaro, Duesberg, Weiss, Gallo y Montagnier, han señalado que las células cultivadas en general, y en particular los cultivos de células estimulados químicamente o células cocultivadas con otras células (los tipos de cultivos prácticamente omnipresentes en la investigación del sida), podrían liberar partículas con aspecto retroviral, incluso aunque no estén infectadas con un retrovirus. Un motivo para este aparentemente extraño e inesperado fenómeno es la presencia en las células de lo que se conoce como retrovirus endógenos (endógeno significa "desde adentro", lo contrario de "exógeno" o "desde afuera"). A diferencia de todos los demás virus, cuya presencia significa adquisición desde fuera, las partículas con aspecto retroviral pueden sugir de novo. Esto es debido a que se dice que los animales, incluyendo a los humanos, nacen con ADN retroviral, que heredan de sus padres. Se estima que alrededor del 10% del genoma humano contiene tales secuencias genéticas retrovirales endógenas. Sin embargo, hasta la fecha no hay pruebas de que estas partículas con aspecto retroviral se transmitan, es decir, sean virus. Gallo está de acuerdo con nosotros. Al responder a una pregunta que se le hizo en un juicio en Australia, Gallo afirmó: "... los retrovirus endógenos no son virus, como su primer testigo [ E.P- Ε] dijo correctamente, son partículas, nunca se han transmitido. Un virus es algo que infecta, que se prueba que va de una persona A a una B. Salvo eso son partículas. Un virus al menos tiene que transmitirse in vitro en el laboratorio, va desde una célula a otra, y eso nunca se ha demostrado para los retrovirus engódenos" (T1298) (18).
4. Las partículas tipo C son ubicuas, y su existencia es principalmente un misterio. En los años 1970 hubo muchos informes de partículas tipo C en pacientes de leucemia humanos, en células embrionarias y en la mayoría de placentas humanas (19).
5. En 1993 Dourmashin et al (20) (21) publicaron datos acerca de partículas con aspecto retroviral libres de células y en gemación en cultivos de linfocitos de cordón umbilical no infectados. Las partículas libres de células tienen un diámetro más pequeño que el atribuido al VIH por la mayoría pero no todos los expertos del VIH.
6. En gradientes de densidad de sacarosa, las partículas de Montagnier no se concentraron a la densidad de 1,16 g/ml, la densidad característica de las partículas retrovirales (ver más adelante).
7. En su artículo inicial, publicado en mayo de 1983, Montagnier dijo que sus partículas eran partículas "tipo C típicas". En su libro Virus (22) (publicado en 2000), Montagnier describió como, el 4 de febrero de 1983, al cortar el ganglio linfático de BRU, él [Charles Dauget, el microscopista electrónico de Montagnier y coautor de su artículo inicial de 1983] encontró partículas con un núcleo muy denso, muy negro en el medio. "Estas imágenes no se correspondían con el HTLV" [página 53] (HTLV-I y HTLV-II son partículas tipo C). Por tanto, dos meses antes de la publicación él sabía que las partículas no eran partículas tipo C, pero sin embargo en su artículo inicial dijo que eran partículas "tipo C típicas". Tanto en su libro Virus como en su carta de Nature Medicine de octubre de 2003 sobre "The historical accuracy of HIV isolation" (23), Montagnier dijo que por junio de 1983 era "claro" para él que el VIH era un Lentivirus. "Un día de junio de 1983, en la cafetería del instituto, discutí nuestros hallazgos y la apariencia morfológica muy específica del virus bajo el microscopio electrónico, con Oswald Edlinger, un virólogo y colega del Pasteur. De nuestra conversación resultó que el LAV se parece mucho al virus de anemia equino infeccioso, que es un lentivirus o 'virus lento' " (página 59). Montagnier despreció los puntos de vista de otros expertos microscopistas electrónicos franceses: "... incluso 'expertos' franceses en microscopía electrónica ponen en duda la naturaleza retroviral del LAV. Supongo que el destino de los pioneros es ¡no ser nunca comprendidos de inmediato! Pero este tipo de ignorancia - ¿simple estupidez o mala fe? - causó retrasos en el desarrollo de los tests de detección, lo cual tendría consecuencias mortales para los hemofílicos y receptores de transfusiones" (página 66).
8. En 1984 el propio Montagnier publicó datos que contradecían su afirmación de que en junio de 1983 era "claro" para él que el LAV era un Lentivirus. En un artículo publicado en Science el 6 de julio (24), Montagnier sostuvo la transmisión de un donante de sangre a un receptor. Los linfocitos de ambos pacientes fueron cultivados y estimulados (incluyendo con PHA). "En el día 2 un cultivo de linfocitos de cada paciente fue cocultivado con células de linfocitos de cordón fetal humano frescas, mediante 5 por ciento de interleucina-2. Se añadieron al cultivo linfocitos de cordon fetal frescos adicionales en los días 10 y 17. Cuatro días después de la ultima adición de linfocitos de cordón fetal, los cultivos se prepararon mediante métodos estándar para microscopía electrónica de sección fina". Los autores afirmaron que "Estas partículas de virus eran indistinguibles de aquellas descritas en la caracterización original del LAV (2, 6), pero eran distintas de la morfología típica del HTLV-I y HTLV-II". La referencia 2 es el artículo de Science de 1983 de Montagnier donde se reportó que el "VIH" era una partícula tipo C "típica", es decir, una partícula con morfología idéntica al HTLV-I y el HTLV-II. Más importante, observando las tres ME's publicadas en este artículo, las partículas no poseen las características morfológicas de ningún retrovirus. Increíblemente, ninguna de las ME's tiene una escala. En un artículo publicado en 1984 (25) (Lancet, 7 de abril), Montagnier describe unos experimentos realizados en julio, agosto y septiembre de 1983 acerca del aislamiento del VIH en dos hermanos con hemofilia B. En la ME publicada se informa de las partículas como partículas de Oncovirus tipo C: "La morfología de estas partículas era similar a la vista en preparaciones de linfocitos T infectados con LAV (5)". La referencia 5 es el artículo de Science de 1983 de Montagnier, donde se reportaron las partículas como "tipo C típicas" (26). También en 1984 Montagnier y sus colegas publicaron otra ME del VIH, esta vez de un cultivo que contenía linfocitos T4 de un donante sano infectado con el VIH aislado de uno de los hermanos con hemofilia. El subtítulo de la ME dice: "Estas partículas son morfológicamente similares a partículas D, como las encontradas en el virus Mason-Pfizer o el virus recientemente aislado a partir del sida de simios" (27). Todo esto significa que un mes después de que sostuviese haber descubierto un nuevo retrovirus en BRU, supo que el VIH era un Lentivirus, aunque no publico ninguna corrección a su artículo de 1983. Además, en 1984 publicó datos que contradecían lo que era "claro" para él en junio de 1983. En otras palabras, si el VIH es realmente un Lentivirus, entonces lo que Montagnier descubrió en 1983 y 1984 no es VIH. En un artículo conjunto de 1988, donde Montagnier y Gallo describen el descubrimiento del VIH por Montagnier en 1983, escribieron: "Las micrografías electrónicas del nuevo virus fueron distintas a las del HTLV-I [partículas tipo C], y se parecían a las de los retrovirus de caballos [Lentivirus]". Sin embargo en 1983 ambos estuvieron de acuerdo en que lo que Montagnier descubrió era un retrovirus "tipo C típico". Esto no es distinto a afirmar que el mismo objeto es un humano, un chimpancé y un gorila.
En ningún sitio de las publicaciones de Montagnier se puede encontrar datos que prueben que el VIH es un lentivirus. De hecho, él admitió que no encontró "homología significativa [parecido] entre el Visna y el LAV". Sin embargo, todavía insiste en que el VIH es un lentivirus (página 57). En lo que se refiere a Gallo, Montagnier escribió: "Science publicó un artículo de su grupo que mostraba parecidos de secuencia entre el HTLV-I, HTLV-II y HTLV-III, y entonces, más curiosamente, entre estos y el prototipo de Lentivirus, el virus de oveja Visna. Los dos conjuntos de hallazgos se probaron como completamente falsos, y nada de estos dos artículos se sostiene por más tiempo. ¡Empezabamos a preguntarnos seriamente si Science no estaba empezando a competir con la Revista de Resultados Irreproducibles!" (página 77).
Según Montagnier: (a) una de las principales características morfológicas de la partícula de VIH es que "tienen forma de pequeñas esferas, cada una con aproximadamente 80 pequeñas proyecciones redondeadas con forma de gancho" (página 88); (b) su principal característica física es que en gradientes de densidad de sacarosa las partículas se concentran a la densidad de 1,16 g/ml. Ninguna de las partículas de las ME's publicadas por Montagnier satisface estas dos condiciones. Por tanto las partículas de Montagnier no pueden ser un retrovirus.
9. Incluso si Montagnier tuviese pruebas de que las partículas en el cultivo de linfocitos de cordon umbilical fuesen virales, su origen podría no haber sido los linfocitos de BRU. Cada diagrama publicado de la partícula de "VIH" muestra que está salpicada con puntas (botones). En su libro Virus, publicado en 2000, Montagnier escribió: "Las partículas de VIH tienen forma de pequeñas esferas, cada una con aproximadamente 80 pequeñas proyecciones redondeadas con forma de gancho", compuestas de la proteína gp120 del "VIH". Según todos los expertos del VIH, incluyendo Montagnier, los ganchos, puntas o botones son absolutamente críticos para la infectividad. Es decir, si una partícula no tiene botones no puede transmitirse, y por tanto no puede ser un virus. No se pueden ver tales botones en las partículas libres de células en el artículo inicial de 1983. De hecho, hasta la fecha, nadie, ni siquiera Gelderblom ha publicado datos que prueben que las partículas de "VIH" libres de células tengan botones. Según Gelderblom y sus colegas, inmediatamente después de ser liberadas de la membrana de la célula, las "partículas de VIH" poseen un promedio de 0,5 botones por partícula, los cuales se pierden rápidamente, pero también señaló que "era posible que pudieran observarse estructuras que se parecen a botones, incluso cuando no estaba presente la gp120 [botones], es decir, falsos positivos" (28). En un artículo publicado en 2003 por investigadores utilizando espectometría de absorción atómica, Kuznetsov y sus colegas contradijeron lo que sostienen prácticamente todos los expertos del VIH. Utilizando el microscopio de fuerza atómica, un tipo de microscopio de sonda de barrido de muy alta resolución inventado en los años 1980, reportaron: "Los grupos de la gp120 no forman puntas en la superficie del VIH, como se describe comúnmente en la literatura. Los grupos apenas son protuberancias. Sugerimos que las puntas, botones, observadas mediante la microscopía electrónica de coloración negativa podrían deberse a la penetración de la mancha de metales pesados entre las proteínas de la envoltura. Ciertamente, el término 'punta' parece haber adoptado una definición más bien imprecisa y posiblemente engañosa, y podría ser mejor que se utilizase con precaución ... Es decir, algunos de los mechones [grupos] de proteínas que observamos podrían representar proteínas celulares" (29). Puesto que los linfocitos de cordón umbilical se cultivaron con "sobrenadante libre de células del cultivo infectado", incluso si el sobrenadante contenía partículas retrovirales, no podían haber sido infecciosas. De modo similar, los dos hermanos con hemofilia no podían haber sido infectados por factor IX contaminado como sostiene Montagnier. De hecho, ningun paciente de hemofilia podía estar infectado por factor VIII o IX contaminado, puesto que estos agentes terapéuticos están fabricados con plasma, que es libre de células. Puesto que el "VIH" en plasma debe ser libre de células, las partículas estarán desprovistas de botones, y por tanto serán no infecciosas (30). En su artículo de Science de 1984, Montagnier afirmó haber infectado las células del donante de sangre sano con el VIH a partir de uno de los hermanos con hemofilia B. Sin embargo, el VIH del paciente con hemofilia se reportó como un tipo C, mientras que el de las células del donante sano "infectado" se reportó como otra especie retroviral, tipo D. Sea cual sea la explicación del "virus" en el cultivo de donante de sangre sano, no puede ser el "virus" del hermano.
10. En 1986, se convocó un subcomité autorizado por el Comité Internacional de la Taxonomía de Virus para "proponer un nombre adecuado de los aislamientos de retrovirus recientemente involucrados como los agentes causales del ¿sida? [FALTA EN EL ORIGINAL].
B. Purificación
Montagnier necesitaba determinar si su virus era HTLV-I, HTLV-II o un nuevo retrovirus. Para hacer eso tenía que comparar la proteína de su "aislamiento" con las de los dos anteriores. Y para hacer eso tenía primero que caracterizar las proteínas de su "aislamiento". Todos los retrovirólogos, incluyendo a Montagnier, están de acuerdo en que el único modo de caracterizar las proteínas virales (y el ARN) es purificar las partículas virales. Es decir, deben obtenerse las partículas virales separadas, aisladas de todo lo demás que no son partículas virales, o como mínimo, de todo lo demás que contiene proteínas (y ARN) (17, 32, 33). Como Gallo señaló en su artículo de 1976 (mencionado antes), el mejor método para purificar partículas retrovirales es el de bandas mediante gradientes de densidad. En gradientes de densidad de sacarosa, los retrovirus se concentran a la densidad de 1,16 g/ml. En la segunda parte de su tercer experimento, Montagnier cogió el sobrenadante del "cultivo de linfocito de cordón umbilical infectado" y lo hizo bandas en un gradiente de densidad de sacarosa. A 1,16 g/ml encontró actividad de RT y afirmó que esta banda era virus "purificado". A las proteínas de la banda de 1,16 g/ml se las hicieron reaccionar con distintos sueros, y fueron "electroforizadas en 12,5 por ciento de gel de bloque de SDS de poliacrilamida. Montagnier halló tres proteínas que reaccionaron con anticuerpos presentes en el suero de BRU: p25, p45 y p80. La p25 no reaccionó con antisuero a la p24 del HTLV-I. Montagnier no hizo comentarios respecto a la p80 o los anticuerpos que reaccionaron con ella. Dijo que la p45 "podría deberse a contaminación del virus con actina celular" (el peso molecular de la actina es 41 kD). Afirmó que la p25 (p24) era una proteína "principal" de su virus. En un artículo posterior, publicado en Science en octubre de 1984, Montagnier escribió: "La banda de 43 kD y la de 84 kD son contaminantes celulares" (34). En otro artículo publicado en 1984 Montagnier escribió: "Los sueros de algunos pacientes de sida se unen con mucha proteína celular. En el ELISA este problema se superó mediante la comparación de la unión del suero al antígeno viral con la unión a un lisado de linfocitos no infectados. Esta unión fue clara en el RIPA [ensayo de inmunoprecipitación de radio], y solamente se consideraron positivos los sueros que precipitaron específicamente la p25 [p24] (35).
COMENTARIOS
1. De los datos de Montagnier surge una pregunta crítica: ¿Sobre qué base podía Montagnier tal vez afirmar que solamente la proteína p24 y los anticuerpos que reaccionaron con ella eran del VIH, pero no ninguna otra proteína o anticuerpo?
2. Al igual que los experimentos primero y segundo, este experimento no se llevó a cabo a ciegas.
3. Incluso si se acepta la detección de actividad de RT en la banda de 1,16 g/ml como prueba de la presencia de un retrovirus, no se puede afirmar que el virus estuviese purificado.
4. ¿Cómo se puede sostener que el virus estaba purificado cuando dos de tres proteínas eran no virales? (34) Si dos eran no virales, ¿por qué no la tercera también?
5. No hay precedente de la existencia de un retrovirus con una proteína.
6. Dada la naturaleza de la reacción anticuerpo-antígeno, incluyendo la reactividad cruzada (36-40), no es posible determinar el origen de un reactivo, mucho menos de los dos, como Montagnier sostiene. Para estar convencido de que todos los "anticuerpos son poliespecíficos, es decir, son capaces de reaccionar con antígenos distintos diversos, tales como las proteínas, los ácidos nucléicos y los haptenos", y de que "son capaces de reaccionar con más que con antígenos propios o no propios, con frecuencia sin similitudes antigénicas aparentes", basta leer las publicaciones científicas de los investigadores, como el Straits Avrameas del Instituto Pasteur (41). Sin embargo, en la entrevista de 1997, Montagnier afirmó "... los anticuerpos son muy específicos. Saben como distinguir una molécula de un millón ... Con los anticuerpos monoclonales se obtiene realmente UNA proteína".
7. Aunque la concentración en gradientes de densidad es el mejor método para la purificación retroviral, mucho antes de la era del sida los retrovirólogos sabían que material distinto a los retrovirus, incluyendo fragmentos celulares, podrían también concentrarse a la misma densidad (42-44). Este es el motivo por el que son obligatorias ME's de la banda de 1,16 g/ml. Sin embargo, aunque Montagnier afirmó que su material concentrado a 1,16 g/ml era virus "purificado", no publico ni siquiera una ME para mostrar que este material contenía partículas de cualquier tipo, viral o no viral, puras o impuras. La no publicación de una ME es incluso más enigmática, dado que en 1972 el principal y el segundo autor del artículo de "aislamiento" de Montagnier afirmaron que el primer paso para sostener una purificación es tener una ME de la banda de 1,16 g/ml mostrando nada más que "partículas sin diferencias aparentes en las apariencias físicas" (5). El motivo de la falta de tal prueba de ME se clarificó en la entrevista de Tahi de 1997, cuando a Montagnier se le preguntó por qué no publicó una ME de su virus "purificado". Respondió que incluso tras un "esfuerzo romano", no pudieron ver ninguna partícula con "la morfología típica de los retrovirus. Eran muy distintas, relativamente distintas". Cuando se le preguntó "¿Por qué no hubo purificación?" contestó: "Repito que no purificamos". Cuando se le preguntó si Gallo consiguió purificar el VIH contestó: "No sé si realmente purificó, no lo creo". La entrevista finalizó con la pregunta: "¿Existen fotos de ME del VIH de la purificación?", a lo que Montagnier contestó: "Sí, por supuesto". Se le preguntó entonces si se habían publicado tales fotos, a lo que respondió: "No podría decirte ... tenemos algunas en alguna parte, pero no tienen interés, ningún interés". En diciembre de 2005, Djamel Tahi entrevistó a Charles Dauget, el microscopista electrónico del Instituto Pasteur y uno de los coautores del artículo de Montagnier de 1983. A Dauget también se le preguntó por qué no se publicaron micrografías electrónicas del VIH purificado. Su respuesta fue: "Nunca hemos visto partículas de virus en el virus purificado. Lo que hemos visto siempre fueron restos celulares, no partículas de virus" (comunicación personal, D. Tahi).
8. En la página 869 de su artículo, Montagnier y sus colegas escribieron: "El que este nuevo aislamiento era un retorvirus fue indicado adicionalmente por su densidad en un gradiente de sacarosa, que era 1,16, y mediante su etiquetado con [3H] uridina (Fig. 1)". Puesto que los virus son partículas se habría esperado que la Figura 1 fuese una ME mostrando partículas retrovirales en la banda de 1,16 g/ml. En vez de eso, la Figura 1 es una gráfica mostrando medidas de la actividad de RT a varias densidades en un gradiente de densidad, las cuales son máximas en la banda de 1,16 g/ml. Los hechos de que:
(a) en la banda de 1,16 g/ml no había partículas con la morfología de los retrovirus, mucho menos un virus singular;
(b) todo lo que estaba presente eran restos celulares;
son una buena prueba de que lo que fuera la actividad de RT, las partículas, sin importar como Montagnier las llamase, tipo C, tipo D o Lentivirus, y la proteína p24 no tienen relación en absoluto con un nuevo o cualquier retrovirus.
CONCLUSIÓN
Los datos del artículo de Science de 1983 de Montagnier no prueban el descubrimiento de un nuevo retrovirus, ni siquiera la detección de ningún retrovirus conocido.
Montagnier cuestionado
La afirmación de Montagnier, así como la de otros expertos del "VIH" respecto al aislamiento del "VIH" ha sido cuestionada por nosotros desde el principio (45, 46). Puesto que Montagnier ni nadie más respondió a nuestra crítica, en 1991 nosotros personalmente se la hicimos saber enviándole algunos de nuestros artículos publicados. Montagnier respondió: "Gracias por su carta del 7 de octubre y los artículos adjuntos. Les responderé tras leerlos". Su carta se puede ver en la referencia 47.
No respondió. En 1992, en un simposio sobre VIH-sida que tuvo lugar en Amsterdam, uno de nosotros (EPE) preguntó a Montagnier respecto al aislamiento del VIH. Montagnier dejó claro que la única prueba de la existencia del VIH es la p24. Todos los otros fenómenos no son específicos. Cuando se señaló que la p24 también era no específica (48-50), Montagnier expresó su sorpresa y respondió que no conocía tales datos. EPE prometió enviarle los datos, y así lo hizo (51), pero Montagnier no respondió (51). En 1993 nosotros publicamos artículos en los que se analizan críticamente en detalle el artículo de Montagnier de 1983 y los cuatro de Gallo de Science de 1984 (36). Ni Montagnier ni Gallo ni nadie más respondió. En 2004 publicamos una crítica detallada del artículo inicial de 1983 de Montagnier. Ni Montagnier ni ninguno de los otros autores respondió (52).
Notas
En toda la literatura del VIH, la detección de trascripción inversa utilizando el cebador-plantilla sintético An.dT12-15 se considera como prueba de detección, producción y aislamiento del "VIH", e incluso cuantificación del mismo. Desde 1987, la detección de una reacción entre un anticuerpo a la proteína p24 del "VIH" de Montagnier y los muchos antígenos en cultivos-cocultivos de células se considera como prueba de aislamiento del "VIH".
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